IAA的生物鉴定
(小麦芽鞘切段伸长法)
原理
将小麦胚芽鞘的延长部分切成段,漂浮在含有生长素的IAA的溶液中,这些切段可以继续伸长,在一定浓度范围内,芽鞘切段的伸长与生长素浓度的对数成正比,因而可通过测定切段伸长的多少来测定生长素的含量。
仪器药品
25℃暗室 滤纸
旋转器 分析天平
小瓷缸 大瓷缸
移液管 青霉素瓶
刀片 小镊子
尼龙网 刻度尺
半对数座标纸 饱和漂白粉溶液
小麦品种:扬麦小号最好用中农28。
100ppmIAA母液:称10mgIAA深于少量无水酒精中,再用水稀释至100ml。此溶液在冰箱中可保存一个月。
缓冲液:称取K2 HPO4 1.794g,柠檬酸1.019g,蔗糖(AR)20g溶于1000ml重蒸馏水中,pH为5.0。
操作步骤
1.挑选大小均匀的小麦种子(必须用前一二年的种子,因当年新收的种子发芽不整齐),用饱和漂白粉溶液灭菌30分钟后,用自来水冲洗半天,放在盛有湿润滤纸的培养皿中,腹沟朝下,在25℃黑暗条件下萌发24小时。
2.当第一胚根出现后,移于用尼龙网覆盖的小瓷缸中,胚根插入尼龙网眼中,如图20所示。
小瓷缸放入盛水的大资缸中,以保持湿度或在小瓷缸上罩上烧杯保湿。
3.继续在25℃黑暗下培养,约40小时后,当胚芽鞘长达3cm左右时,选取2.8─3.0cm幼苗作为生物鉴定的材料,因这样大小的芽鞘对IAA最敏感。
4.切去芽鞘尖端3mm,取下面5mm切段作试验,如图21所示。
5.将5mm切段漂浮在重蒸馏水中浸洗2─3小时,除去切段中内源激素。
6.配制0.001、0.01、0.1、1.0、10ppm的IAA的系列标准溶液(配在具塞试管中)。
吸取 100ppm IAA 1ml 9ml缓冲液→10ppm IAA
吸取 10ppm IAA 1ml 9ml缓冲液→1ppm IAA
吸取 1ppm IAA 1ml 9ml缓冲液→0.1ppm IAA
吸取 0.1ppm IAA 1ml 9ml缓冲液→0.01ppm IAA
吸取 0.01ppm IAA 1ml 9ml缓冲液→0.001ppm IAA
7.在具塞青霉素瓶中分别吸入上述IAA系列标准溶液(0.001、0.01、0.1、1.0、10ppm IAA)2ml,另外吸取2ml缓冲液作为对照。
8.切段浸泡后,用滤纸将切段表面水分吸干,在上述盛有不同浓度生长素的青霉素瓶中,分别放入芽鞘切段10段(最好放11─12段,以便挑选)加塞,每一浓度重复3次。将青霉素瓶置于旋转器上(旋转速度为16r/min)在25℃暗室中旋转培养。
9.上述操作均需在暗室中绿光下进行。
10.旋转培养20小时后取出芽鞘切段,在滤纸上吸干,测量芽鞘切段的长度。
11.在半对数坐标纸上,以芽鞘切段增长%*为纵坐标,IAA浓度为横坐标,作出标准曲线。在生长素浓度为0.001─1.0ppm范围内,切段的伸长与生长素浓度的对数成正比,如需鉴定某一植物提取液中生长素含量,必须与标准的IAA作对照。