影响凝胶电泳色谱仪电泳迁移率的因素

影响凝胶电泳色谱仪电泳迁移率的因素有样品的物理性质、支持物介质、电场强度和缓冲液等。

一、样品的物理性质：

1、分子大小：

线状双链DNA分子长度（碱基对数目bp）的常用对数与迁移距离成反比，以此来测定DNA片段（线性双链）的分子量准确且方便。

当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶很难将它们分开，此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小。因此，用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过20kb。

2、分子的空间构型：

即使分子量相同，而空间构型不同，迁移率也不同。

DNA分子的空间构型对迁移率的影响很大，如DNA分子迁移率的大小顺序为共价闭环DNA＞直线DNA＞开环双链DNA。

3、带电量：

核酸分子是两性解离分子，当pH = 3.5时，碱基上的氨基解离，而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离，所以核酸分子带正电，在电场中向负极泳动。当pH = 8～8.3时，碱基几乎不解离，而磷酸基团解离，所以核酸分子带负电，在电场中向正极泳动。不同核酸分子的电荷密度大致相同，对迁移率影响不大。

4、碱基组成：

碱基组成对迁移率影响不明显。

二、支持物介质：

核酸电泳通常使用聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶两种介质。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（CH₂ = CH－CO－NH₂，简称Acr）和交联剂N，N′－甲叉双丙烯酰胺（CH₂ = CH－CO－NH－CO－CH = CH₂，简称Bis）在催化剂过硫酸铵（AP）和加速剂N，N，N′，N′－四甲基乙二胺（TEMED）作用下聚合交联而成为三维网状结构，其网孔大小由Acr与Bis的相对比例决定。琼脂糖是一种聚合链线性分子，含有不同浓度的琼脂糖凝胶构成的分子筛网孔大小不同。

凝胶浓度越小，孔径越大。反之，凝胶浓度越大，孔径越小。

三、电场强度：

电场强度为1～5V/cm时，线性DNA迁移率与电场强度成正比。但凝胶的有效分离范围随着电场强度增大而减小，使分辨率下降。这是因为随着电场强度的增大，不同长度DNA迁移率的增加程度不同。

四、缓冲液：

1、种类：

（1）TAE（Tris、醋酸和EDTA）：缓冲能力差，电流大易发热，长时间使用阴极为碱性，阳极为酸性，需循环使两极的pH一致。价格便宜。

（2）TBE（Tris、硼酸和EDTA）：缓冲能力强。应TBE。

（3）TPE（Tris、磷酸和EDTA）：缓冲能力强，但易与DNA一起沉淀，影响酶反应。

（4）TNE（Tris、醋酸钠和EDTA）：电流大，适合长时间低压电泳，分辨率高。

2、缓冲液pH：

缓冲液pH决定带电颗粒的解离程度。缓冲液pH常偏碱性或中性，此时核酸分子带负电，向正极移动。

3、缓冲液离子强度：

缓冲液离子强度小，溶液的导电性小，带电颗粒泳动慢。

缓冲液离子强度大，溶液的导电性高，带电颗粒泳动快。缓冲液离子强度过高，产生大量热，会使凝胶熔化和DNA变性。