实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光集团，利用荧光信号来实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板浓度进行定量分析。
病原学检测是动物疾病确诊的关键点，而聚合酶链式反应（PCR）是目前病原检测的最常用的分子生物学技术，具有高敏感性的特征。PCR技术发展已日趋完善，并在此基础上建立了实时荧光定量PCR、套式、多重、降落PCR等技术，逐渐成为实验室常规检测手段。本文主要向大家介绍新希望六和动保中心目前在猪病诊断中应用较多的实时荧光定量PCR检测技术，让大家悉知本方法的原理及结果解读。
荧光定量PCR原理
荧光定量PCR（Real-time PCR），是指在PCR扩增反应体系中加入荧光基团，通过对扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
以探针法荧光定量PCR为例：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。开始时，探针完整地结合在DNA任意一条单链上，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，检测不到荧光信号；PCR扩增时，Taq酶将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
传统的PCR进行检测时，扩增反应后需要进行染色处理及电泳分离，并且只能作定性分析，不能准确定量，易造成污染出现假阳性，使其应用受到限制。实时定量PCR技术不仅实现了对模板的定量，且具有灵敏度高、特异性和可靠性更好、自动化程度高和无污染的特点，使得荧光定量PCR逐渐取代常规PCR。
荧光定量PCR的分类
分为核酸染料法和探针法。核酸染料法实验设计简单，不需要设计探针，仅需要一对引物，但是核酸染料法对双链的结合并没有特异性，容易使实验结果出现假阳性信号。动保中心全部采用探针法，此方法只有与探针结合的片段上发生扩增才能收集到荧光信号，增加了反应的特异性；另外如果对探针的5’端采用不同的荧光标记就可以进行多重荧光定量PCR。
结果解读
一般而言，荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光信号指数扩增阶段， PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析。为了方便定量和比较，在实时荧光定量PCR技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和CT值。
图1 荧光定量PCR扩增曲线 注：x-轴表示PCR循环数，y-轴表示扩增反应的荧光值，Ct值是指每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数，起始拷贝数越多，Ct值越小。
图2 荧光定量PCR标准曲线 注：利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
动保中心常用检测项目
动保中心实验室设计了特异性的引物和TaqMan-MGB探针，建立了特异性检测PRRSV、PRV、PEDV和CSFV等的TaqMan荧光定量 PCR检测方法。所建立的这几种荧光定量检测方法特异性良好，敏感性均高于普通PCR检测方法，可定量病原含量，同时大大提高了检测效率（检测时间从6小时缩短至3小时以内）。
表1 新希望六和动保中心猪病常用荧光定量PCR检测项目
小结
应用实时荧光定量PCR方法同时辅助病原分离、序列测定等手段，能够及时、准确的对疾病作出诊断。动保中心实验室对检测的方法的更新与改进持续进行，例如多重荧光定量PCR检测方法建立等，以期更好的为养殖场服务。
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