1 目的:保证扩增及结果分析的标准化、规范化。
2 该SOP变动程序:本文件的变动，可由任一使用该文件的工作人员提出，报经室技术负责人，由季度组长会议决定。如通过则公布实行。
3 使用范围:使用GeneAmp 5700型扩增仪的实时荧光定量PCR实验室。
4 标准程序
4.1 核酸扩增标准程序
扩增反应前须先在GeneAmp 5700 SDS 软件的设置面板上按照事先排好的标本位置进行设置。每次实验除了待检标本，还要包括一个阴性对照、一个阳性对照、一个阳性室内质控品、一组阳性标准品（4个梯度106、104、103、102）。
⑴依次打开电脑显示器和电脑主机的电源开关，进入Windows NT界面。
⑵接着打开光源检测器和PCR仪电源开关，预热5分钟。
⑶双击GeneAmp 5700 SDS 图标，打开软件。
⑷在New plate Application 窗口分别选定5700/SYBR Green， 然后单击OK，打开一空白设置面板。
⑸在Setup 版面设定样品种类与名称，数量。
①在Type栏中选择类别：STND－标准梯度，UNKN－未知样品，
NTC－阴性对照，Not in use－未使用
②再在Name栏中依次输入样品名称。
③在框定所选标准梯度孔数后，需在工具栏中单击P窗口，选定PR1 primer SYBR后，关闭窗口，可见所选孔左下角有一长方形阴影。
④ 在框定所选孔数后，在工具栏中单击Q窗口，即可在此窗口输入定值标准品的标准量。
⑹点Instrument 即可在此窗口设定循环参数。
⑺选定任务栏File中的Save项，弹出对话框。在对话框中的File Name项下输入一组数字和（或）字母组成的文件名，选Save。
⑻检查设置正确与否。
⑼运行程序：
①在设置完程序文件的Instrument窗口，点RUN键，即可运行。
②反应结束后，选任务栏File中的Save项，保存实验结果。
4.2 结果分析标准程序
对于5700结果曲线的分析，应按以下步骤进行：
全部曲线——阴性对照——阳性对照——阳性室内质控品——阳性标准品——逐个分析（标出阳性标本和可疑标本）——调整参数，获得较好的标准曲线，显示定量结果——登记，发报告。
⑴整体曲线的观察
将所有曲线选中进行整体观察
①观察是否存在污染情况（包括标本污染和试剂污染），特别应注意大量曲
线在同一Ct值出现上涨的情况。
②观察是否有光路传导阻滞或电压波动等机器原因形成的异常曲线。
⑵阴性对照的分析
阴性对照：试剂中加入与待检标本进行同样处理的已知阴性标本。
作用：用以监测实验室和前处理过程中是否存在污染。
⑶阳性对照的分析
阳性对照：试剂中加入与待检标本进行同样处理的已知阳性标本。
作用：用以监测实验能否正常检出阳性标本，避免假阴性的出现。
⑷阳性室内质控品的分析
阳性室内质控品：试剂中加入与待检标本进行同样处理的已知或未知浓度的阳性室内质控血清。
作用：用以监控日常实验的精密度。
⑸阳性标准品的分析
①各梯度曲线的分布是否均匀，若各梯度曲线均未分开，则表明阳模稀释可存在问题，提示实验中存在较大人为误差。
②观察各曲线的Ct值是否在平日的正常位置。
情况1：若出现低拷贝标准品做不出，而各曲线Ct 值均后移，则判断是否为试剂扩增效率下降（如试剂过期或保存条件不合格）。
情况2：出现低拷贝标准品做不出，而高拷贝曲线Ct值均正常，则提示可能存在低拷贝阳性标准品的降解情况。
③每日必做102标准品，用作以下三方面监控：
A是否存在操作误差，如加样量过少等原因导致102标准品未能检出。
B是否存在稀释后的梯度放置过久，低拷贝标准品降解的情况。
C若高拷贝标准品出现Ct值后移，且能排除情况A、B，则判断是否为试剂
灵敏度下降。
⑹单个曲线的判断
逐个分析每条曲线，判断曲线的阴阳性或属可疑曲线。（可疑标本是指曲线在37个Ct值后出现上涨且平台趋势不明显或上涨幅度比较低的标本。可疑标本要第二天重做，两次结果一致则报阳性，否则结果报阴性。）曲线观察内容：在基线选择2～8时观察△Rn值大小（是否有三期特征）。在基线选择0～0时观察Rn值曲线形状。
⑺得出定量结果
调节基线和阈值以得到一较好的标准曲线。电脑据此曲线给出阳性结果值。此时应排除某些阴性标本因假性上扬而得出的假阳性结果和某些弱阳性标本因荧光信号值过低而显示的假阴性。
⑻发放报告
及时登记检测结果记录，发放临床报告。
首页
