本文对苹果酒中有机酸的高效液相色谱(HPLC)进行了系统的研究。优化了色谱柱型、流动相、流速、检测波长等色谱条件。
1、实验材料
实验室制备苹果酒样品；L-苹果酸（色谱纯度）；L-乳酸（色谱纯度）；L malic酸（分析纯度）；甲醇（色谱纯度）；甲酸（色谱纯度）。
2、实验仪器
分析天平0.1mg；
漩涡混合器 ；
数控超声波清洗器 ；
循环式多用真空泵 ；
高效液相色谱仪 ，配紫外检测器 ；
pH计 。
3、样品预处理
在室温下平衡苹果酒样品后，用滤纸过滤样品，然后用0.45μm微孔滤膜过滤，稀释3.3倍并直接注入。
4、仪器及其条件
色谱柱：C18 （3.5um X4.6mm ×75mm ）；
柱温：25℃ ；
流动相为甲酸0.1%＋3%甲醇，在使用前用0.45μm混合纤维膜进行真空过滤。
流速 ：0.5mL／min ；
进样量 ：20ul；
检测波长：210nm 。
有机酸的表征：将苹果提取液的色谱图与苹果酸和乳酸的标准色谱图进行比较。根据保留时间对苹果酒中有机酸的种类进行了初步确定，并加入样品外标法和谱图数据进行了辅助定性分析。
有机酸的定量测定：以对羟基苯甲酸和L-乳酸混合标准溶液为母液，稀释至6的浓度（苹果酸5000, 4000, 3000，2000, 1000和500毫克/升；乳酸2000, 1500, 1000，500, 200和100毫克/升）。
根据高效液相色谱仪的分析条件，对各浓度梯度的混合样品进行了检测，并在每个水平点进行了三次注射，以质量浓度(X，mg/L)绘制了峰面积(Y)，绘制了标准曲线。
5、色谱柱的选择
在苹果酒中有机酸的高效液相色谱检测中，优化有机酸的色谱分离条件，包括色谱柱类型、流动相比、流速、检测波长等。
液相色谱柱是高效液相色谱分离体系，对混合物中各组分的准确定性和定量分析具有重要的作用。为了使苹果酒在高效液相色谱中具有良好的分离效果，首先对色谱柱进行了优化。
本实验选 用了3 种型号的柱子 ，即
①C18柱 ，5um ×4.6mm× 250mm ；
② T3柱，5um × 4.6mm ×250mm；
③ C18柱，3.5um ×4.6mm ×75mm 。
以苹果酸和乳酸混合标准样品和自制苹果酒为研究对象，对三柱的分离效率进行了研究。在相同的洗脱工艺下，对三柱色谱柱进行了测试，在相同的分析时间下，T3柱具有较好的分离效果。考虑到类似的分离效果，C18柱能在短时间内有效分离苹果酸和乳酸，仅需12分钟。可以对样品进行分析。这是因为C18柱(3.5um×4.6mm×75 mm)是一个快速分离柱。该柱的粒径比普通柱小，为3.5um。与传统的高效液相色谱法相比，快速分离柱高效液相色谱具有分离时间短、分析速度快、流动相消耗少、分析成本低的优点。为了有效地完成实验，在各峰分离效果良好的前提下，尽可能缩短了分离所需的时间，然后选用C18(3.5μm，4.6mm，75 mm)色谱柱作为实验分析柱。
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