6.10 菌株鉴定用和特殊用途试剂
6.10.1 组氨酸—生物素平板
成分：琼脂粉 15g
蒸馏水 944mL
(V-B)培养基E 20mL
20%葡萄糖 20mL
灭菌盐酸组氨酸水溶液(0.5g/100mL) 10mL
灭菌0.5mmol/L生物素溶液 6mL
配制：高压灭菌琼脂和水后，将灭菌20%葡萄糖，V-B培养基和组氨酸溶液加进热的琼脂溶液中。待溶液稍为冷却后，加入灭菌生物素，混匀，浇制平板。
6.10.2 氨苄青霉素平板和氨苄青霉素/四环素平板
成分：琼脂粉 15g
蒸馏水 940mL
(V-B)盐溶液 20mL
20%葡萄糖 20mL
灭菌盐酸组氨酸溶液（0.5g/100mL） 10mL
灭菌0.5mmol/L生物素溶液 6mL
氨苄青霉素溶液(8mg/mL于0.02mol/LNaOH中) 3.15mL
四环素溶液(8mg/mL于0.02mol/L HCl中) 0.25mL
配制：琼脂和水高压灭菌20min，将无菌的葡萄糖、VB盐溶液和组氨酸—生物素溶液加进热的溶液中去，混匀。冷却至大约50℃，无菌条件下加入四环素溶液和/或氨苄青霉素溶液。
应该在倾注琼脂平板后几天内，制备主平板。
6.10.3 营养琼脂平板
成份：琼脂粉 7.5g
营养肉汤培养基 500mL
配制：于0.103MPa下高压灭菌30min后倾注平板。
7 试验菌株及其生物学特性鉴定
7.1 试验菌株
采用TA97、TA98、TA100和TA102一组标准测试菌株。
7.2 生物学特性鉴定
新获得的或长期保存的菌种，在试验前必须进行菌株的生物特性鉴定。菌株鉴定的判断标准，如表1所示。
表1 试验菌株鉴定的判断标准
| 菌株 | 组氨酸 缺陷 |
脂多糖屏障缺损 | 氨苄青霉素抗性 | 切除修复缺损 | 四环素 抗性 |
自发回变菌落数* |
| TA97 TA98 TA100 TA102 |
+ + + + |
+ + + + |
+ + + + |
+ + + - |
- - - + |
90-180 30-50 100-200 240-320 |
| 注 | “+”表示需要组氨酸 | “+”表示具有rfa突变 | “+”表示具有R因子 | “+”表示具有△uvrB突变 | “+”表示具有pAQ1质粒 | *在体外代谢活化条件下自发回变菌落数略增 |
7.2.1 组氨酸缺陷
原理：组氨酸缺陷型试验菌株本身不能合成组氨酸，只能在补充组氨酸的培养基上生长，而在缺乏组氨酸的培养基上，则不能生长。
鉴定方法：将测试菌株增菌液分别于含组氨酸培养基平板和无组氨酸平板上划线，于37℃下培养24h后观察结果。
结果判断：组氨酸缺陷型菌株在含组氨酸平板上生长，而在无组氨酸平板上则不能生长。
7.2.2 脂多糖屏障缺损
原理：具有深粗糙（rfa）的菌株，其表面一层脂多糖屏障缺损，因此一些大分子物质如结晶紫能穿透菌膜进入菌体，从而抑制其生长，而野生型菌株则不受其影响。
鉴定方法：吸取待测菌株增菌液0.1mL于营养琼脂平板上划线，然后将浸湿的0.1%结晶紫溶液滤纸条与划线处交叉放置。37℃下培养24h后观察结果。
结果判断：假若待测菌在滤纸条与划线交叉处出现一透明菌带，说明该待测菌株具有rfa突变。
7.2.3 氨苄青霉素抗性
原理：含R因子的试验菌株对氨苄青霉素有抗性。因为R因子不太稳定，容易丢失，故用氨苄青霉素确定该质粒存在与否。
鉴定方法：吸取待测菌株增菌液0.1mL，在氨苄青霉素平板上划线，37℃下培养24h后观察结果。
结果判断；假若测试菌在氨苄青霉素平板上生长，说明该测试菌具有抗氨苄青霉素作用，表示含R因子，否则，表示测试菌不含R因子或R因子丢失。
7.2.4 紫外线敏感性
原理：具有△uvrB突变的菌株对紫外线敏感，当受到紫外线照射后，不能生长，而具有野生型切除修复酶的菌株，则能照常生长。
鉴定方法：吸取待测菌株增菌液0.1mL于营养琼脂平板上划线，用黑纸盖住平板的一半，置紫外灯下照射（15W，距离33cm）8秒钟。置37℃下孵育24h后观察结果。
结果判断：具有△uvrB突变的菌株对紫外线敏感，经辐射后细菌不生长，而具有完整的切除修复系统的菌株，则照常生长。
7.2.5 四环素抗性
原理：具有pAQI的菌株对四环素有抗性。
鉴定方法：吸取待测菌株增菌液0.1mL于氨苄青霉素/四环素平板上划线，置37℃下孵育24h后观察结果。
结果判断：假若测试菌照常在氨苄青霉素/四环素平板上生长，表明该测试菌株对氨苄青霉素和四环素两者有抗性，具有pAQI质粒，否则，说明测试菌株不含pAQI质粒。
7.2.6 自发回变
原理：每种试验菌株都以一定的频率自发地产生回变，称为自发回变。这种自发回变是每种试验菌株的一项特性。
鉴定方法：将待测菌株增菌液0.1mL加到2mL含组氨酸—生物素的顶层琼脂培养基的试管内，混匀后铺到于底层琼脂平板上，待琼脂固化后，置37℃培养箱中孵育48h后记数每皿回变菌落数。
结果判断：每种标准测试菌株的自发回变菌落数应符合表1要求。经体外代谢活化后的自发回变菌落数，要比直接作用下的略高。
7.2.7 回变特性—诊断性试验
原理：每种试验菌株对诊断性诱变剂回变作用的性质以及S9混合液的效应不一。
鉴定方法：按照平板掺入试验的操作步骤进行。将受试物换成诊断性诱变剂。
结果判断：标准菌株对某些诊断性诱变剂特有的回变结果参见表2。
表2 测试菌株的回变性
| 诱变剂 | 剂量(mg) | S9 | TA97 | TA98 | TA100 | TA102 |
| 柔毛霉素 叠氮化钠 ICR—191 链霉黑素 丝裂霉素C 2,4,7-三硝基-9-芴酮 4-硝基-O-次苯二胺 4-硝基喹啉-N-氧化物 甲基磺酸甲酯 2-氨基芴 苯并（a）芘 |
6.0 1.5 1.0 0.25 0.5 0.20 20 0.5 1.0 10 1.0 |
- - - - - - - - - + + |
124 76 1640 inh inh 8377 2160 528 174 1742 337 |
3123 3 63 inh inh 8244 1599 292 23 6194 143 |
47 3000 185 inh inh 400 798 4220 2730 3026 937 |
592 188 0 2230 2772 16 0 287 6586 261 255 |
注：inh表示抑菌。表中数值均已扣除溶剂对照回变菌落数。
8 大鼠肝微粒体酶的诱导和S9的制备
8.1 诱导
最广泛应用的大鼠肝微粒体酶的诱导剂是多氯联苯（PCB混合物），选择健康雄性大鼠体重200g左右，一次腹腔注射诱导剂，剂量为500mg/kg体重。诱导剂溶于玉米油中，浓度为200mg/mL。苯巴比妥钠和β-萘黄酮结合也可做为诱导剂。
S9制备
动物诱导后第五日断头处死。处死前12h停止饮食，但可自由饮水。首先，用75%酒精消毒动物皮毛，剖开腹部。在无菌条件下，取出肝脏，去除肝脏的结缔组织，用冰浴的0.15mol/L氯化钾溶液淋洗肝脏，放入盛有0.15mol/L氯化钾溶液的烧杯里。按每克肝脏加入0.15mol/L氯化钾溶液3mL。用电动匀浆器制成肝匀浆，再在低温高速离心机上，在4℃条件下，以9000g离心10min，取其上清液（S9）分装于塑料管中。每管装2 mL ~3 mL。储存于液氮生物容器中或-80℃冰箱中备用。
上述全部操作均在冰水浴中和无菌条件下进行。制备肝S9所用一切手术器械、器皿等，均经灭菌消毒。S9制备后，其活力需经诊断性诱变剂进行鉴定。
9 溶剂的选择
如果受试物为水溶性，可用灭菌蒸馏水作为溶剂；如为脂溶性，应选择对试验菌株毒性低且无致突变性的有机溶剂，常用的有二甲基亚砜（DMSO）、丙酮、95%乙醇。一般操作中，为了减少误差和溶剂的影响，常按每皿使用剂量用同一溶剂配成不同的浓度，固定加入量为100ml。
10 剂量的设计
决定受试物最高剂量的标准是对细菌的毒性及其溶解度。自发回变数的减少，背景菌变得清晰或被处理的培养物细菌存活数减少，都是毒性的标志。
对原料而言，一般最高剂量组可为5mg/皿。对产品而言，有杀菌作用的受试物，最高剂量可为最低抑菌浓度，无杀菌作用的受试物，最高剂量可为原液。受试物至少应设四个剂量组。每个剂量均做三个平行平板。
11 试验操作步骤
11.1 增菌培养
取营养肉汤培养基5mL，加入无菌试管中，将主平板或冷冻保存的菌株培养物接种于营养肉汤培养基内，37℃振荡（100次/min）培养10h。该菌株培养物应每毫升不少于1～2×109活菌数。
11.2 平板掺入法
实验时，将含0.5mmol/L组氨酸-0.5mmol/L生物素溶液的顶层琼脂培养基2.0mL分装于试管中，45℃水浴中保温，然后每管依次加入试验菌株增菌液0.1mL，受试物溶液0.1mL和S9混合液0.5mL（需代谢活化时），充分混匀，迅速倾入底层琼脂平板上，转动平板，使之分布均匀。水平放置待冷凝固化后，倒置于37℃培养箱里孵育48h。记数每皿回变菌落数。
实验中，除设受试物各剂量组外，还应同时设空白对照、溶剂对照、阳性诱变剂对照和无菌对照。
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