中空纤维场流分离技术(HF5)与非对称场流分离技术(AF4)相结合的场流分离技术(FFF)是一种性能强大的蛋白质、抗体类药物成分分离、分馏的新方法。
场流分离法(F4)是多种不同的分子和颗粒分离技术的总称。其中使用最为广泛的是非对称场流分离技术AF4。这种非对称场流分离技术的工作原理是：在一个扁平的长通道里进行分离。扁平通道的上方是完全不透水、透气的上界板，但下方的半熔玻璃料表面却有一层超滤膜。也就是说：扁平通道的下方是不透的。这也就意味着：只允许一定尺寸大小的溶解剂(水、缓冲剂等等)和分子透过去。
分离过程是从向产品喷射溶解剂开始的。在喷射了溶解剂之后就开始在通道中有液体流淌，在通道的两端之间捕获住所需的产品;用专业术语来讲称之为聚集。而溶解剂则通过不透性的下界板流出了扁平通道。这时第二股液体流来了;这是一股与通道流向垂直的横流，推动着产品向半透膜的方向运动。两股力在聚集区的综合作用力出现了平衡，使得每一个分子都有着与自己大小相应的位置(根据其具体的初始系数)。较大的颗粒靠近半透膜，而较小的颗粒则远离半透膜。而最终的产品成分分离是根据颗粒大小进行分离的;分馏物被送入检波器中进行特性测定。
几年前，大分子分离时还只有SEC/GPC体积阻排色谱法一种方法可供使用，但这种方法常常与被分析物之间因一些相互作用而带来麻烦、问题。因此在这种不容易分离的间距任务中人们更多的选择了FFF场流分离技术。而HF5中空纤维场流分离技术就是在FFF场流分离技术基础上发展起来的新技术。这种分离技术中的扁平通道由不透性的中空纤维膜和多孔的通道壁组成的。当流动的液体流过这些纤维时，一部分液体可从多孔的通过壁中渗出，并构成横向流动的横流。在它的作用下产品成分开始被分离出来了。这一技术方法与AF4非对称场流分离一样是基于被分离元素不同的扩散系数和流体动力学半径及分子质量基础之上的(参见图1)。
图1.HF5中空纤维场流分离的分流条件(radial flow=径向流 radial field lines=径向电场线)。
HF5中空纤维场流分离技术的应用领域与其他场流分离技术的应用领域相似。但这种中空纤维场流分离技术的一个显著优点就是：所需的稀释很少，以及与此有关的很高的检测灵敏度。迄今为止的应用结果表明：这一技术不仅在制药工业领域中而且在石油化工产品研发领域中都是一个非常重要的工具。生产中空纤维的聚合物价廉物美，因此经济性的HF5中空纤维半透膜可以作为一种一次性的半透膜来使用。
由于制药生产领域多种多样不同的分析要求，在不抛弃AF4非对称场流分离技术的同时把HF5中空纤维场流分离技术作为额外附加的一种分离方法来使用是非常有意义的。因此，开发一种既能使用AF4非对称场流分离通道又能使用HF5中空纤维场流分离通道的场流分离系统就显得非常必要了。通道和液体喷射器的整体控制可以使用(Wyatt欧洲公司研发生产的)Eclipse Dualtec控制仪来控制。
图2.本研究中所使用的组合式仪器设备。前排蓝色支架内的是分离通道和中空纤维场流分离筒。
该仪器由下列主要部件组成(参见图2)：
• AF4和HF5的控制系统：Eclipse的Dualtec(Dernbach，Wyatt技术欧洲公司);
• 探测器：18度光散射器(MALS执行器)Dawn Heleos II;差示折光计 Optilab rEX(Wyatt技术欧洲公司，Santa Barbara，美国);
• HPLC高效液相色谱仪：脱气机的Agilent1100，单元泵安捷伦1100，自动进样器的Agilent 1200，安捷伦1100(VWD)检测仪(安捷伦科技公司，圣克拉拉，美国)
高检测灵敏度
图3.HF5敏感性提高情况与AF4的比较
与AF4非对称场流分离技术相比较，中空纤维技术的最重要特点是样本稀释较低。这就有可能提供检测的灵敏度了(参见图3)。与两种不同的AF4相比较(SC：短通道和LC：长通道)，图中所示HF5中空纤维场流分离技术很强的紫外线信号表示的是：酶蛋白的碳酸酐酶是馈送量的函数。通道的高度是具有可比性的(HF5的半径为400um，AF4的通道高为350um)。由于通道流量只有很小的100ul，因此HF5分离技术的最高峰值提高了4～6倍。
图4所示是一种蛋白质混合物的分离情况。被分离的成分有：1 - 碳酸酐酶(1mer);2 - 牛血清白蛋白(1mer)+碳酸酐酶(2mer);3 - 碳酸酐酶(3mer) ;4 - 牛血清白蛋白(2mer);5 - 去铁铁蛋白(1mer);6 - 甲状腺球蛋白(1mer)+去铁铁蛋白(2mer);7 - 去铁铁蛋白(3mer)+甲状腺球蛋白(2mer)。
图4.利用HF5场流分离技术对复杂蛋白质混合物进行检测分析得到的结果几乎与基线分离的结果相同。紫外线信号为215nm。
图4所示蛋白质混合物场流分离图谱清楚的告诉我们：被分离样本中所包含的物质—无论是单体还是低聚物—都可以毫无问题的分离出来。它几乎达到了基线分离的水平。二聚物和低聚物的探测，就像我们这里举例说明的那样，就是治疗用抗体药物质量监控对分析技术提出的一个重要挑战。这类物质的比例不允许超过特定的百分比。否则会使患者服用后感到不适。下面的例子将会更加详细的讨论这一问题。
图5.HF5场流分离得到的抗体主要组成成分：片段、单体、二聚物。紫外线信号为215nm。
抗体类药物的压力测试
图5所示为抗体制备的标准。从中可以看出各个组成部分的正态分布，也就是碎片、单体、少量二聚体的正态分布情况。免疫球蛋白这类较大的聚集体这里是检测不到的。
图6.抗体制备后进行热学压力处理后可以检测出其中的聚集物。
但在另外一种根据设定状况作背景的压力测试得出的结果如图6所示。这里设定的背景状况是一个热力学过程：抗体在-20摄氏度的低温下冷冻存放了若干天，然后重新解冻。将药剂在40摄氏度左右的温度下放置几小时也有着同样的效应。许多小的抗体分子会聚集成较大的聚集物。这就导致这些药剂不在适合使用了，必须丢弃。因此在药品生产过程中不断的检查、监测，避免这种聚集物的形成是非常重要的了。迄今为止，利用柱色层法一直不能对此进行充分的检测;但现在的HF5中空纤维场流分离技术就是完成这类检测任务最合适的工具了。
小结
这一研究报告清楚的表明：所介绍的HF5中空纤维场流分离系统有着与性能可靠的AF4非对称场流分离系统一样好的分离效果。尤其是中空纤维有着很好分离结果的简单处理方法，包括‘随时候补’都表明它是一种最佳方法。尤其是在治疗性蛋白质的分析领域中，场流分离是一件非常有价值的分析工具：利用这一工具可以满足许多完全不同的检测分析要求。一方面，它所需要的高价值检测样本量非常少，只要能够满足高灵敏度检测分析的要求就可以了。另一方面--例如抗体类药物的质量控制时，人们常常要与高浓度的药物材料打交道。即使是在这种情况下也必须绝对准确、可靠的进行检测;只有这样才能得到分子量、分子大小、溶解度和聚集度等的可靠数据。这对所用工具和方法提出的要求和挑战是非常明确的：在很宽的浓度范围内经久耐用的、有着很好重复再现性能的检测分析技术。把AF4非对称场流分离和HF5中空纤维场流分离结合在一起就满足了这一前提条件，将会成为未来许多分析问题最佳的解决方案，尤其是在治疗性肽或者蛋白质特性的检测中。
色块
综合分馏
由AF4非对称场流分离和HF5中空纤维场流分离两种分馏技术结合在一起的双轨制分馏方法为用户提供了最高尺度的检测灵敏性、使用灵活性和检测分析能力。不仅仅只是它的应用范围大于SEC/GPC体积阻排色谱法;而且它没有与色谱柱所用材料之间的相互作用问题，避免了高敏感性被测材料的剪切力问题，能够干净利落的、重复再现的、柔和的完成分馏。这为那些过去利用柱层析法检测复杂蛋白质分子、较大颗粒物时常常受到分析仪器设备性能限制的用户提供了极大的方便和好处。
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