张丽华发文：N-磷酸化修饰蛋白质的富集和鉴定方法

　　摘要

　　蛋白质磷酸化修饰在细胞的信号转导、代谢、发育等生命过程中发挥着重要作用。除了研究较为透彻的发生在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸侧链羟基的O-磷酸化修饰之外，近年来，发生在组氨酸、精氨酸和赖氨酸侧链氨基的N-磷酸化修饰受到了越来越广泛的关注。然而，由于N-磷酸化修饰具有独特的P-N键结构，导致其化学稳定性差。尤其是在O-磷酸化肽段富集常用的酸性条件下，N-磷酸化极易丢失。因此，目前对N-磷酸化蛋白质的研究仍处于初始阶段。该文针对蛋白质N-磷酸化修饰的特点、富集和鉴定方法进行了综述，并对其发展前景进行了展望。

　　自1906年被首次报道以来, 蛋白质磷酸化修饰作为关键调节因子受到了越来越广泛的关注。到目前为止, 发现约有30%的人类蛋白质可能在某些时刻被磷酸化, 约500种蛋白激酶和少量的蛋白磷酸酶调节着磷酸化过程。同时, 蛋白质的磷酸化能够影响诸多生理过程, 包括免疫反应、内分泌作用、神经机制和行为、胃肠道行为和肌肉骨骼调节等。此外, 由于激酶或磷酸酶突变导致的异常磷酸化会引起一些信号通路的异常, 成为某些疾病发生的诱因。

　　除了众所周知的蛋白质O-磷酸化修饰, 即磷酸化发生在丝氨酸(pSer)、苏氨酸(pThr)和酪氨酸(pTyr)的侧链羟基上外, 还有一类发生在碱性氨基酸——组氨酸(pHis)、精氨酸(pArg)和赖氨酸(pLys)的侧链氨基上, 称为N-磷酸化修饰。由于其在信号转导方面发挥重要的生物学功能, 越来越受到人们的关注。然而, 由于其特殊的化学不稳定性质, 目前针对蛋白质N-磷酸化修饰的研究仍处于初级阶段。本文针对蛋白质N-磷酸化修饰的特性与功能, 以及富集和鉴定方法进行了综述。

　　01特性与功能

　　与O-磷酸化修饰中的P-O键相比, N-磷酸化修饰中的P-N键水解的吉布斯自由能(ΔG°)较高。例如pHis的氨基磷酸酯键水解释放的能量(ΔG°为-12.0~-13.0 kcal/mol)约为pSer、pThr或pTyr的磷酸酯能量(ΔG°为-6.5~-9.5 kcal/mol)的两倍, 因此热力学稳定性较差。此外, 氨基磷酸酯在动力学上也不稳定。氮原子的孤电子对和磷酰胺π键重叠较少, P-N键不能形成像P-O键一样稳定的电子离域结构, 因此在酸性条件下P-N键的氮的质子化促进了磷酰基的解离, 从而容易发生去磷酸化。N-磷酸化修饰的不稳定性给其分析带来了巨大的挑战。

　　在蛋白质N-磷酸化修饰中, pHis是研究最为成熟的。根据咪唑环上磷酸化位置的不同, pHis具有1-pHis和3-pHis两种异构体。Boyer等最先在大鼠肝线粒体中发现了pHis蛋白质。尽管在原核细胞中pHis修饰的丰度(约6%)高于pTyr(约1%), 但哺乳动物中有关pHis的报道较少。哺乳动物的第一个磷酸化组氨酸磷酸酶直到2002年才被鉴定。现有研究表明, pHis在细菌、真菌和植物中的双组分和多组分磷酸信号传导途径中起主要作用。随着生物化学和质谱技术的发展, 人们发现pHis对哺乳动物很多细胞生命过程, 如信号传导、染色质组装和离子传导等, 都有重要影响。目前已知NME1和NME2是哺乳动物的两个pHis激酶, 而LHPP是对应的pHis磷酸酶。

　　与pHis类似, pArg主要存在于细菌等原核生物中。在1994年对蛋白质精氨酸激酶McsB进行分离和鉴定后, Wakim等首次证实了原核生物中pArg的存在。2009年, Clausen等发现McsB在枯草芽孢杆菌转录调节中具有重要作用。随后, 最初被认为是pTyr磷酸酶的YwlE被发现为pArg磷酸酶, 在细菌和黑腹果蝇pArg调节中发挥作用。最新研究表明, pArg是受损原核蛋白诱导蛋白水解的标记物。然而, McsB在真核生物中的作用尚未完全阐明。

　　相比于pHis和pArg, pLys的研究相对较少, 因此它的生物学意义仍然不明确。到目前为止, pLys仅在再生大鼠肝脏中的组蛋白H1上发现。研究人员从活细胞中分离出几种激酶和磷酸酶, 并且暗示它们对赖氨酸的磷酸化起到调节作用。由于具有相似的化学性质和稳定性, 因此推测pLys可能具有与pHis和pArg类似的作用。

　　综上所述, 尽管蛋白质N-磷酸化在原核生物中的功能报道较多, 但目前在哺乳动物中的研究仍亟待深入。

　　02富集方法

　　由于生物样本中蛋白质N-磷酸化的丰度低, 质谱信号易受高丰度组分抑制, 因此对N-磷酸化蛋白质/肽段进行有效富集已成为提高其检测灵敏度的必要和关键步骤。目前, N-磷酸化蛋白质/肽段的富集方法主要包括抗体法、固定化金属亲和色谱法和色谱保留时间差异法等。

　　此外, 还有一些研究者通过生物分子相互作用来实现N-磷酸化蛋白的有效富集。Hofmann等报道了来自Src激酶的SH2结构域可以与pArg肽段结合(Kd=550±150 μmol/L), 并通过进一步突变SH2结构域有望实现pArg肽段的有效富集。Trentini等开发了pArg磷酸酶YwlE的突变体, 保留了对pArg蛋白质的亲和力； 将其用来富集枯草芽孢杆菌Δyw1E细胞提取物中的pArg蛋白质, 发现pArg蛋白质在原核细胞的信号传导方面发挥重要作用。但是, 此方法只能用于pArg蛋白质的特异性富集, 而且YwlE突变体的制备较为繁琐。

　　03检测技术

　　蛋白质组学技术的发展为N-磷酸化修饰蛋白质/肽段的规模化鉴定提供了有力的工具。目前, N-磷酸化蛋白质/肽段的检测主要采用ESI-MS/MS和MALDI-TOF MS。此外, P31NMR也被用于N-磷酸化修饰的检测。

　　其他检测方法包括：Wei和Matthews开发了一种基于膜的方法, 用于检测pHis； 即在常规的激酶测定反应后进行温和的碱性水解, 在高pH下将产物吸附到Nytran纸上, 在pH 9条件下, 通过液体闪烁计数测定纸上的放射性, 并结合pHis的酸不稳定性使其能够只针对pHis进行检测。此外, Sun等开发了一种碘化标记方法:由于咪唑基团上的氢被磷酸基团取代, 因此无法用碘来标记pHis位点, 而可以完全碘化未修饰的His, 从而将两种组氨酸位点区分开。但由于以上这两种方法缺乏富集过程, 因此N-磷酸化肽段受到非磷酸化肽段的严重干扰。此外, Wagner和Vu通过薄层色谱从[γ-31P]ATP标记的pHis蛋白质的碱水解产物中用放射自显影检测到1-和3-pHis。有报道使用邻苯二甲醛对氨基酸进行衍生化, 并在pH 7.2的聚合物基反相柱(Hamilton PRP-1)上进行HPLC分离, 使用14.3 mmol/L磷酸钠, 1.1%(v/v)四氢呋喃, 6.6%(v/v)乙腈的等度洗脱条件, 可以完全区分1-pHis、3-pHis和pArg。

　　总结与展望

　　本文综述了N-磷酸化蛋白质/肽段富集和鉴定方法的研究进展。通过合成稳定的N-磷酸化氨基酸类似物, 可以开发出了一系列针对pHis和pArg的抗体, 并实现相应类型的N-磷酸化蛋白质/肽段的富集。然而, 由于pLys结构更柔软, 难以产生有效的免疫反应, 因此针对pLys的抗体仍未见报道。此外, 基于IMAC材料和色谱保留时间差异的方法能够实现pHis和pLys肽段的有效富集。在检测方法中, 由于MS具有高通量和高准确度的特点, 在N-磷酸化蛋白质/肽段的检测中显示出巨大潜力。

　　然而目前蛋白质N-磷酸化修饰的研究才刚刚起步, 仍有很多问题亟须解决。首先, 现有的富集方法难以实现中性条件下N-磷酸化蛋白质/肽段的富集, 因此需要开发更温和高效的富集方法。第二, 生物样本中存在相对高丰度的O-磷酸化蛋白质/肽段, 会造成N-磷酸化蛋白质/肽段富集效率低、离子化效率低和位点定位不准确的问题, 因此发展去除O-磷酸化蛋白质/肽段的方法是十分必要的。第三, 在采用正离子模式MS情况下, 常用的酸性流动相会造成N-磷酸化修饰一定程度的水解, 因此亟须发展针对N-磷酸化肽段分离的流动相添加剂, 或是发展高效的负离子模式。最后, 由于N-磷酸基团容易在MS碎裂时发生中性丢失, 因此还需发展适合于N-磷酸化修饰鉴定的MS采集方法。对于新发现的N-磷酸化蛋白质, 其功能尚未揭示, 因此需要推进相关生物学研究。