腺相关病毒(AAV)载体是治疗多种人类疾病基因传递的主要平台。最近在开发临床所需的AAV衣壳、优化基因组设计和利用革命性生物技术方面的进展对基因治疗领域的发展作出了重大贡献。在AAV介导的基因替换、基因沉默和基因编辑方面的临床和临床上的成功帮助AAV作为理想的治疗载体获得了广泛的应用。
腺相关病毒AAV基础
AAV属于细小病毒科的依赖病毒属，它的生命周期依赖于辅助病毒(如AdV)的存在。AAV存在于多种脊椎动物中，包括人类和非人类灵长类动物.目前的共识是，AAV不会引起任何人类疾病，它由直径为26nm的二十面体蛋白衣壳和一个单链DNA基因组组成，单链DNA基因组约为4.7kb，既可以是正链，也可以是负(反义)链。
衣壳由VP1、VP2和VP3三种亚单位组成，共60拷贝，比例为1：1：10(VP1：vp2：vp3)。基因组两侧有两个T形倒置末端重复序列(ITRs)，主要作为病毒复制的起源和包装信号。REP基因编码四种病毒复制所需的蛋白质；它们是根据它们的分子质量命名的：Rep78、Rep68、Rep52和Rep40。
Cap基因通过不同起始密码子的选择性剪接和翻译，编码三个衣壳亚基。此外，编码组装激活蛋白(AAP)的第三个基因在不同的读框中编码在Cap编码序列中，并已被证明能促进病毒子组装。AAV基因组可以整合到人类细胞中的一个称为AAVS1的基因组位点中以潜伏。这一现象在一定程度上是由于aavs1中发现的序列相似性以及ITR和REP活性。由于rAAV没有REP基因，rAAV基因组整合大大减少。基因治疗使用AAV多为重组AAV（rAAV)。
腺相关病毒AAV外壳改造
自20多年前rAAV被证明具有临床应用前景以来，为获得新的特性而设计的新型AAV衣壳一直是科学家不断追求的目标。发展新的衣壳的战略随着技术的进步而发展。例如，低温电子显微镜(cryo-EM)提供了关于衣壳残基的结构和功能对稳定性的影响，以及抗体如何识别和附着在衣壳蛋白上的深入研究。这加速了新衣壳的鉴定和验证。衣壳开发方法可分为三大类：自然发现、合理设计和定向进化。近年来，随着计算能力和生物信息预测方法的改进，AAV衣壳设计出现了一个新的分支：硅发现。下面将讨论这些方法的优缺点，以及一些证明这些方法的基础的开创性研究。
自然发现的衣壳
正如上文所讨论的，AAV最初被发现为细胞培养污染物，这就是最广泛使用的血清型AAV 2。值得注意的是，最具临床应用前景的载体血清型是从自然来源分离出来的。这一概念最好的缩影是AAV9，它是从人肝组织中分离出来的。AAV9是一种clade F型血清型，具有绕过血脑屏障(BBB)的能力，使其成为中枢神经系统(CNS)通过全身给药传递的主要衣壳。肝脏和脾脏是人类和非霍奇金淋巴瘤(NHPs)自然AAV感染的主要部位，尽管前病毒序列可以从63-67个组织中分离出来。例如，最近引起关注的其他人类来源的cladeF衣壳是从CD34+人外周血造血干细胞中分离出来的，这表明它们具有进行无核酸酶基因编辑能力。
流行病学分析表明，40%-80%的人血清抗AAV抗体呈阳性反应，这表明人类源性衣壳可能并不是理想的基因治疗载体，因为已经存在的AAV衣壳免疫可能会降低传导效率。血清流行病学和分子学研究表明，AAV1、AAV2、AAV3、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9是人类特有的。因此，从非人类来源分离衣壳可以克服免疫原性的问题。从非霍奇金杆菌中分离出的衣壳已显示出很大的希望，NHP衍生的AAVrh.8、AAVrh.10和AAVrh.43(CladeE衣壳；AAV8也是成员)已被证明能传递一系列组织。然而，抗AAV8中和抗体(Nabs)在人类人群中的流行率从10%到40%不等，有地域差异。其他的E类衣壳因此可能表现出反应性。
许多研究现在集中在从其他脊椎动物种类分离出来的AAV衣壳的前景上，虽然这些衣壳在理论上诱发病人预先存在的免疫反应的可能性最低，但它们在人类中也可能表现出较低的传导。值得注意的是，有报道称猪源性的rAAV可以传递小鼠器官，其效率与金标AAV相媲美.最有希望的是，猪AAV不能被人免疫球蛋白G(IgG)中和，并且具有传递成年小鼠大脑的能力，这表明这些载体可以绕过BBB。
随着高通量测序方法的进步，天然囊泡多样性的发现变得简化。长读测序技术，例如单分子、实时(SMRT)测序允许在不需要序列重构的情况下对全长的临时基因组进行测序。由于在来自个体患者的组织活检样品中观察到多个AAV血清型，因此该技术提供了观察由于几个AAV基因工程之间的自然重组的结果的变体的能力。
合理设计的衣壳
第一批改进载体衣壳的方法是通过合理的设计进行工程设计。这种策略首先是简单地嫁接与细胞类型特异性受体结合的肽序列。整合素结合肽序列被引入衣壳表面，导致AAV2重新靶向抗感染细胞。其他方法是将肽序列融合到VP2的氨基酸末端，例如单链可变片段(ScFVS)90和设计的ankyrin重复蛋白(DARPins)，使细胞表面标记物具有类似抗体的识别能力。另外，人们普遍认为，3倍突起在形成衣壳的定向和免疫原性方面起着重要作用，从而使3倍突起的暴露位置成为肽插入增强受体结合的理想位置。这种方法不仅可以延缓衣壳，而且还具有阻止免疫识别的能力。值得注意的是，在临床试验中使用的第一个工程载体衣壳，AAV 2.5是合理设计的衣壳。该衣壳通过将AAV1中的5个氨基酸转移到AAV2衣壳支架上，表现出较好的肌肉传导能力。
虽然对衣壳结构的合理修改可能会改善其定向性，但它也可能对衣壳的其他特性(如稳定性)产生负面影响。引入密码子扩充（codon expansion）和点击化学技术，对病毒组装后的衣壳进行修饰。通过利用三重突起的柔韧性，点击化学氨基酸修饰，在不影响组装和包装的情况下，改变衣壳功能。
另一种通过合理设计改善载体转导的方法是破坏衣壳细胞的降解。定点突变表面暴露酪氨酸残基，通过抑制蛋白酶体降解和促进细胞内转运，使小鼠肝细胞转导增加了近30倍。
尽管引入了高通量筛选方法，合理设计在新载体的工程中始终占有一席之地。例如，最近报道的AAV2真型(AAV-TT)衣壳是通过结合来自血清AAV2阳性儿童的天然AAV2变异体中的保守残基而设计的AAV-TT比AAV2具有更高的热稳定性，更重要的是在小鼠中具有良好的中枢神经系统转导。值得注意的是，AAV-TT也缺乏作为AAV2结合位点的硫酸肝素蛋白多糖(HSPG)结合基序，这可能是AAV2在培养细胞中适应性选择的结果。HSPG在细胞外基质中的高表达导致AAV2在非靶组织中的扩散和固存减少，从而限制了AAV2系统传递的疗效。虽然AAV-TT缺乏通过血脑屏障的能力，但它代表了一种设计合理的衣壳，可能对需要骨髓间充质载体的治疗有用。
结构-功能关系的解析，为一些AAV衣壳合理设计中提供了重要的线索。由这种结构信息引导,从天然AAV9衣壳变体中分离出天然AAV9衣壳变体,与原型AAV9不同的黑猩猩组织由4个残基组成，其中两个残基位于3倍的突起处。当这两个残基在AAV9上突变时,设计的衣壳，称为AAV9.HR，在注射小鼠后，AAV9易通过血脑屏障进入大脑，减少进入外周组织。极大地降低了目标从周围组织中。
定向进化的衣壳
对合理设计方法的一个主要限制是有关AAV细胞表面结合、内化、贩运、脱衣和基因表达的知识不足。因此，新的发现方法，即定向进化策略，在许多情况下都是有利的。
定向进化的基础是模拟自然进化，在这种情况下，衣壳受到选择性压力，产生具有特定生物学特性和有利特性的遗传变异(例如，组织特异性靶向、免疫回避和转基因表达)。因此，衣壳库的定向进化并不需要事先了解选择标准所涉及的分子机制。
另外，在离散区域或整个cap基因上的易错配PCR也是筛查生成衣壳库的一种可行方法。最近的许多研究也利用了从预先存在的血清型的初级序列随机产生嵌合衣壳。与易错配PCR相结合，衣壳改造可以通过调查具有内在不同取向特征，更广泛的预先存在的衣壳，从而实现衣壳库的更大多样性。值得注意的是，有限针对HIV-1-infected H9 T cells的rAAVs已经进化出来了。
另一个值得注意的定向进化方法是基于Cre重组的AAV靶向进化(CREATE）.这种方法也使用随机肽片段插入3倍突起，依赖于Cre重组来修复设计到载体基因组中的反式多腺苷化序列。由于Cre重组需要一个双链DNA靶标，只有能够介导单链病毒基因组在胞内有效转运和转化为细胞核内双链形式的衣壳，才能在表达Cre的细胞中进行cre重组酶的处理。这一方法导致鉴定了AAV-PHP.B和其他能穿过血脑屏障的衣壳变异体。
随着下一代测序方法的出现，定向进化已经成为发现新型载体衣壳的一种更加强大的技术。筛选几千个条形码转基因的能力，允许重复富集可以传递细胞或组织类型的候选基因。这些技术的唯一真正的限制是，衣壳的进化需要在一个最能模仿目标组织的模型中进行。
硅生物信息学方法
二级、三级和四级结构相互作用，在单体内部和单体之间施加的结构约束，增加了评估未被研究的衣壳结构域的诱变结果时的复杂性。计算工具的使用极大地改进了矢量设计方法，而不需要完全了解AAV衣壳生物学。例如，结合高通量测序，可以使用生物信息工具来设计衣壳变异库，以确定允许操作的高变异性区域。事实上，在硅质化的新型衣壳工程中，近年来受到了广泛的关注。例如，在硅质系统发育和统计模拟已知的衣壳序列推断进化中间体，祖先衣壳序列已经预测了。结果发现Anc80对小鼠肝脏、骨骼肌、视网膜和耳蜗有良好的治疗作用。同样，在几种有袋类动物的种系内源性病毒元件(EVES)的硅序列分析中，发现宿主DNA内存在病毒整合事件。这些EVEs被描述和重建为新的祖先衣壳，具有潜在的理想载体特性。
rAAV组织靶向基因治疗
考虑到AAV的自然取向性和未得到满足的医疗需求，大多数rAAV基因治疗方案侧重于肝脏、横纹肌和中枢神经系统。全身给药后，几乎所有的天然AAV衣壳都能有效地传输肝脏。因此，rAVVs为治疗各种疾病提供了强有力的肝靶向平台，如血友病a和血友病b、家族性高胆固醇血症、鸟氨酸转糖化酶缺乏症和Crigler-Najjar综合征。衣壳如AAV8和AAV 9可以针对全身多种肌肉类型，使rAAV基因疗法能够被开发用于多种肌肉疾病，尤其是那些折磨全身肌肉的疾病，如DMD。虽然大多数心脏病是多基因的，并且受环境因素的影响，但有几个与信号和代谢有关的基因已被测试用于治疗心脏衰竭。
临床开发中rAAV基因治疗的很大一部分集中在中枢神经系统上，包括脑区，眼球。眼睛是一个受限制和分隔的器官，可以直接引导rAAV基因的传递。值得注意的是，美国食品和药物管理局(FDA)批准的第一种rAAV基因治疗药物,美国费城生物技术公司Spark Therapeutics开发的药物“Luxturna”用于先天性黑朦的基因疗法治疗,治疗由RPE65基因突变引起的遗传性视力丧失患者。相比之下，大脑要复杂得多，体积也要大得多。
直接脑实质内注射rAAV可导致rAAV的局部分布，是治疗帕金森病患者中枢神经系统疾病(如帕金森氏症中的壳核)的理想方法。鞘内注射至脑脊液间隙，可获得更广泛的中枢神经系统分布。不幸的是，这些管理途径可能是侵入性的，并构成很大的风险。或者，静脉注射某些血清型载体，如AAV9和AAVrh.10，已经允许载体穿过血脑屏障来传递神经元和胶质细胞。
这一具有里程碑意义的发现导致了一系列研究，证明了全身性rAAV治疗中枢神经系统广泛分布的疾病的疗效，包括脊髓性肌萎缩症(SMA)、肌萎缩侧索硬化症、卡纳文病、GM1神经节苷脂增多症和粘多糖样病。利用这种强大的rAAV平台进行的多项临床试验目前正在进行中。
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