通过研究斑马鱼来揭示视网膜生物钟活性

昼夜节律和视网膜生物钟

人类以及许多其他动物体，睡眠-清醒循环以及其他的生物节律过程是由内源性振荡器-生物钟所调节的。生物钟受一系列基因控制，这些基因的表达因是否有光照所微调，从而使得每日的生物节律适应于日夜循环交替。

在哺乳动物的大脑中，生物钟母钟（主要的控制因子）位于下丘脑视交叉上核。然而它并非每日节律的单一控制因子。体内还有其他的一些节律振荡器，比如视网膜生物钟，调节神经视网膜的很多生理活动。

斑马鱼的视网膜生物钟

斑马鱼的视网膜

尽管普遍认为视网膜生物钟响应外部光线强弱调节视觉灵敏度，但对其明确的机理和基因作用了解甚少。斑马鱼的视网膜结构以及功能和哺乳动物包括人类近似，这是将斑马鱼作为视网膜生物钟实验研究模型的重要优势。因此斑马鱼视网膜节律基因的研究对于人类视网膜生物钟的认识可能具有重要意义。

值得提及的是，合肥微尺度物质科学国家实验室和中国科学院脑功能与疾病重点实验室的黄姓研究员等人最近研究了斑马鱼的Per 2基因。 Per 2基因被认为对视网膜生物钟机制具有重要作用。 这个基因片段是光调节基因，在持续的无光条件下，Per 2基因的表达会被极大抑制。 

创造斑马鱼的基因突变体来研究视网膜生物钟

研究某指定基因片段的功能通常是创造一个缺失该基因的表型来和自然存在的最普遍的野生表型对比。黄姓研究员等人就是采用了该方法。他们制作了缺失Per 2基因的斑马鱼幼体，进行了各种解剖学，分子生物学以及行为表现研究来比对突变表型和野生表型。

斑马鱼的Visiobox和Zebrabox的测试

黄姓研究员等人做的行为分析的其中一项是视动力反应测试(OKR)。测试分析可以反映视力和对比敏感度。在这项测试中，斑马鱼幼体被固定在下面有红外线光源的培养皿里。光源在幼体周围发射出旋转光栅。光栅引起眼球运动，会被红外敏感CCD镜头实时捕捉。在不同的空间频率（0.02, 0.04, 0.06, 0.08周/度）条件下测试视力情况。对比敏感度用‘Gain’值（增益）也就是眼球运动速度与刺激条纹速度的比值来衡量。此项实验项目更好的选择是采用Viewpoint公司所研发的Visiobox产品，该产品致力于改善实验的精确度，分析方法以及再现性。其都将归功于Visiobox强大的自动观测和跟踪斑马鱼幼体的视觉行为的功能。

   
_{VisioBox系统影像输出斑马鱼的视动反应测试（OKR）}

黄姓研究员团队也进行了斑马鱼幼体的视觉运动反应（VMR）的实验研究。该研究是使用ZebraBox系统进行的。ZebraBox可以实现自动观测和跟踪斑马鱼幼体，同时研究数量可多达96条。采用这个技术可以实现实验条件的全方位控制。斑马鱼幼体（突变表型和野生表型）被分别放置在96个孔板里。在正式实验之前，这些幼体被置于ZebraBox系统提供的完全无光条件下3.5小时以适应该条件。之后突然瞬间调整光照条件。幼体的每一秒的动作都被系统一帧帧记录下来。对斑马鱼幼体样品的其他测试包括免疫组织化学，实时荧光定量PCR，电镜成像等，这样可以观测视网膜的结构成分和基因表达。

_{斑马鱼仔鱼行为观察箱(ZebraBox)}

数据分析

在对行为数据进行统计分析之后，黄姓研究员等人确定了缺乏per 2基因片段的个体会在白天表现出对比敏感度减弱的迹象以及视力低下。但即使缺乏per 2基因片段仍然具备视动力反应昼夜节律。

针对Per 2基因突变体在light-on模式（光电传感器动作模式）视觉运动反应表现出缺陷的情况，他们决定对视网膜结构变化进行研究，他们认为视网膜结构的变化可能是引起视力减弱的原因。通常认为视网膜异常的突触带可能导致了视力低下，因此他们进行了解剖学和分子生物学研究。果然，黄姓研究员团队发现在突变体中，突触带和突触后进程没有联系，甚至和拱形致密区以及突触前膜没有关联。他们推断per 2基因对于锥形视蛋白的表达有重要作用，因此导致了视网膜结构变化。

数据转化结论

根据上面提及到的，研究证明时钟基因对视网膜形成视觉的功能很重要。缺失per 2基因的斑马鱼突变体表现出对比敏感度和视力低下的情况。尤其缺失per 2基因的斑马鱼在白天的的视动力反应测试的gain值降低。然而，它们即使缺乏per 2基因片段仍然具备视动力反应昼夜节律。这有可能是因为per 2基因片段对于分子钟或者行为节律影响不大。另外，per 2突变体表现出视网膜突触带异常和数量减少的现象，这可能是导致视力低下的原因。

该研究的未来展望

综上所述，per 2基因突变的斑马鱼尽管在视网膜中时钟基因的节律表现正常，但因异常的突触带而变现出来视力低下的情况。从数据来看，时钟基因影响了视觉功能，是因为阻碍了神经发育而并非是昼夜节律失调。研究阐述了per 2基因在调节视觉过程中的主要作用机制。为未来视网膜生物钟控制的准确遗传学机理研究以及将经验类推到哺乳动物甚至人类身上开辟了新的思路。
 
参考文献
Huang D, Wang M, Yin W, Ma Y, Wang H, Xue T, Ren D and Hu B. (2018). Zebrafish Lacking Circadian Gene per2 Exhibit Visual Function Deficiency. Front. Behav. Neurosci. 12:53. doi: 10.3389/fnbeh.2018.00053