靶向序列捕获和新一代测序前对石蜡包埋组织及...（二）

捕获前扩增

四个 DNA 样品按照样品前处理工作流程（图 1）进行进一步处理。对捕获前扩增样品进行五次 PCR 循环，然后采用 DNA 1000 试剂盒在 2100 生物分析仪上进行分析（图 3）。
 

图3. 使用 Agilent 2100 生物分析仪及安捷伦 DNA 1000 试剂盒分析所得的捕获前扩增样品的电泳叠加谱图。样品：FFPE DNA Q（红色），FFPE DNA A（蓝色），新鲜冷冻组织 DNA（绿色），对照 DNA（浅绿色）

所有 DNA 样品的谱图在大约 100 至 900 碱基之间十分类似。平均分子量为 307 至 348 碱基之间，最大峰高位于 254 至 271 碱基之间（表 1）。未观察到任何扩增假体或引物二聚体。此外，2100 生物分析仪可自动提供弥散条带的 DNA 浓度，其介于 23 至 90 ng/µL 之间。

表 1 捕获前扩增文库的平均分子量、峰高及定量

捕获后扩增

SureSelect 实验方案中的最后一个 DNA QC 步骤需要对捕获后样品进行 10 次循环扩增，然后采用高灵敏度 DNA 试剂盒在 2100 生物分析仪上进行分析（图 4）。观察结果表明，所有四个样品的电泳谱图较为一致，弥散条带从 225 至 600 碱基，峰高为 314 至 336 碱基（表 2）。分子量分布及 DNA 文库的产量均在 Illumina 末端配对多重测序所推荐的范围之内（2 × 76 bp 读长）。
 

图4. 使用 Agilent 2100 生物分析仪系统及高灵敏度 DNA 试剂盒分析所得的捕获后扩增文库的电泳叠加谱图。样品：FFPE DNA Q（红色），FFPE DNA A（蓝色），新鲜冷冻组织 DNA（绿色），对照 DNA（浅绿色）

表 2 捕获后扩增文库的平均分子量、峰高及定量

结论

在 SureSelect 靶向序列捕获的样品前处理工作流程中，2100 生物分析仪被应用于 FFPE 样品的 NGS 样品 QC。可靠的 DNA 芯片电泳可提供弥散条带谱和详细的文库统计信息，例如峰高、平均弥散条带分子量、分子量分布和 DNA 浓度。FFPE、相匹配的新鲜冷冻组织，以及对照细胞系 DNA 所得结果适用于下游的Illumina 平台测序。

参考文献
 
1. Tang, W., David, F. B., Wilson, M. M., Barwick, B. G., Leyland-Jones, B. R., and Bouzyk, M. M., “DNA Extraction from Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissue”, Cold Spring Harbor Protocols, doi:10.1101/pdb.prot5138, 2009.
2. Kirill Gromadski, Rüdiger Salowsky, Susanne Glück, “Improving sample quality for SureSelect target enrichment and next-generation sequencing with the Agilent High Sensitivity DNA kit”（采用安捷伦高灵敏度 DNA 试剂盒提高SureSelect 靶向序列捕获及新一代测序的样品质量），安捷伦科技应用简报，出版号 5990-5008EN，2010
3. “SureSelect Target Enrichment System for Illumina Paired-End Sequencing”
（适用于 Illumina 末端配对测序的
SureSelect 靶向序列捕获系统），安捷伦科技操作手册，出版号 G7530-90000， 2012
4. “Agilent High Sensitivity DNA Kit Guide”
（安捷伦高灵敏度 DNA 试剂盒指南），安捷伦科技操作手册，出版号 G2938-90321， 2009
5. “Agilent DNA 1000 Kit Guide”（安捷伦DNA 1000 试剂盒指南），安捷伦科技操作手册，出版号 G2938-90014，2006