基于EVAGREEN®方法的CRYSTAL数字PCR绝对定量检测

基于EVAGREEN^®方法的CRYSTAL数字PCR绝对定量检测

EvaGreen^®是一种无致突变性、无细胞毒性的DNA结合染料，Naica^TM Crystal全自动微滴芯片数字PCR仪系统可兼容EvaGreen^®染料进行的数字PCR实验分析。

反应体系中游离的的EvaGreen^®染料不发出荧光信号，但与双链DNA（dsDNA）结合后会发出很强的荧光。Naica^TM Crystal全自动微滴芯片数字PCR仪系统使用检测参比荧光（荧光素钠盐）相同的滤光片可进行EvaGreen^®染料荧光信号的检测。

使用Naica^TM Crystal全自动微滴芯片数字PCR仪系统，EvaGreen^®可以通过使用简单的引物来实现靶标绝对定量。使用我们的Sapphire芯片、基于EvaGreen^®的方法可检测低至0.2copies/μL。

图1：基于EvaGreen^®染料方法的基因组DNA绝对定量

对未进行片段化的人基因组DNA进行倍比稀释，浓度范围从1000-0.2copies/μL，使用Naica^TM Crystal全自动微滴芯片数字PCR仪系统进行绝对定量，使用1.5XEvaGreen^®，1XPerfeCTa @ UNG Tough mix，扩增片段大小为104bp的EGFR基因片段。为了保证重复性和稳定性我们进行了三次重复（R²= 0.9977）。在NTC（无模板对照）孔中没有观察到阳性微滴。

EVAGREEN^®核酸绝对定量实验的建立

当使用EvaGreen^®方法进行数字PCR实验时，需要注意，加入PCR mix的模板dsDNA浓度过高将导致较高的背景荧光。此外，EvaGreen^®染料与dsDNA具有较高的亲和力，但同时也与存在mix中的寡核苷酸有较低的亲和力，导致背景荧光的增加。

根据您所需定量的DNA类型和数字PCR反应体系，需要预估实际的动态范围。

图2：EvaGreen^®绝对定量散点图

对未片段化的人类的基因组DNA进行倍比稀释后，浓度范围1000-0.2copies/µL，使用Naica^TM Crystal全自动微滴芯片数字PCR仪系统进行绝对定量，使用1.5XEvaGreen^®，1XPerfeCTa @ UNG Tough mix，扩增片段大小为104bp的EGFR基因片段。

灰色点：阴性微滴，蓝色点：阳性微滴。

RFU：相对荧光强度。