环保、 低耗气 New Brunswick S41i CO2 恒温摇床培养杂交瘤细胞及中国仓鼠卵巢（CHO） 细胞
Nick Kohlstrom, George Wang, Linette Philip and Ma Sha, Eppendorf Inc., Enfield, CT, U.S.A.
摘要
在本研究中 New Brunswick S41i CO2 恒温摇床培养哺乳动 物细胞的可行性首次通过培养中国仓鼠卵巢细胞（CHO） 得 到了验证。 并将其与市售两款主流 CO2 恒温摇床的性能进行 比较。 使用 New Brunswick S41i 培养杂交瘤细胞在细胞生 长速率和活细胞率方面与其他同类产品相比性能同等， 同时 研究还比较 CO2 气体的消耗量， 凭借高端的环保设计及先进 的参数控制， New Brunswick S41i CO2 恒温摇床的气体消 耗量与同类产品相比低于其 10 倍之多， 显示出优越的性能。
综述
汽车不仅仅是 CO2 气体排放的唯一来源， 实验室设备， 例如 CO2 培养箱每年可以产生超过 2 万升的 CO2。 Eppendorf 提出 环保倡议来减少其产品对环境造成的影响。 大多数培养箱消 耗的 CO2 被排放到大气中， 而 Eppendorf 的新型恒温摇床 — New Brunswick S41i 在正常的细胞培养条件下释放极少量的 CO2， 并且不影响摇床的性能。 本研究通过培养杂交瘤细胞及 中国仓鼠卵巢细胞（CHO） 评估了 New Brunswick S41i 恒温 摇床的性能。 本研究还比较 New Brunswick S41i 恒温摇床与 其他同类产品的 CO2 消耗量。 数据揭示 New Brunswick S41i 恒温摇床的 CO2 消耗量与同类型产品相比低 5 倍到 10 倍之多， 其碳足迹亦低于同类产品 5 倍到 10 倍。
高端的设计减少气体的泄漏， 紧固密封的玻璃内门被外门所保 护， 牢固密封的驱动结构使其与培养腔体隔离。 基于细胞培 养的生长速率、 细胞密度及活细胞率的比较 New Brunswick S41i 恒温摇床的性能处于业界领先地位。
这一款新型 CO2 培养箱配置四个偏心驱动为悬浮细胞的生长提 供精确及稳定的环境控制。 摇床驱动器经优化后， 可在潮湿和 二氧化碳富集的环境中保持高性能。
材料和方法
| 设备 > 配置有高温消毒功能的 New Brunswick S41i CO2 恒温摇床 > 同类产品 1 > 同类产品 2 > Vi-CELL® 分析仪（贝克曼库尔特， 德国） > YSI 2700® 分析仪 （YSI 生命科学， 美国） > New Brunswick Galaxy® 气体分析仪 > Omega® FMA-1608A 热质量流量计（Omega 工程， 美国） > Eppendorf 耗材 - Research® plus 单通道移液器 - epT.I.P.S® - Easypet® |
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培养基和细胞：
> DG44 中国仓鼠卵巢细胞（英杰公司）
> EX-CELL® 化学成分明确的中国仓鼠卵巢细胞无血清培养基 （西格玛公司）
> 杂交瘤细胞 DA4-4； 美国模式培养物保藏所： HB57
> DMEM 培养基（美国模式培养物保藏所， ATCC）
> 5% 胎牛血清（Gibco 公司）
> 100x 青霉素（Gibco 公司）
中国仓鼠卵巢细胞（CHO） 培养方法
CHO 细胞在加入有 1% 抗生素—青霉素（EX-CELL®） 的中国 仓鼠卵巢细胞无血清培养基中生长。 6 个 250 mL 锥形瓶各以 60 mL 培养基接种 , 接种密度为 3×105 cells/mL。 且每个锥形 瓶从同一批培养基制备得来。 锥形瓶被放置在摇床板上六个不 同的位置， 结果均一化。 锥形瓶在 37 °C， CO2 浓度为 5%， 空气含量为 95%， 转速为 130 RPM（4.69 rcf） 的条件下进 行培养。
CHO 细胞的生长周期为 14 天， 分别使用 YSI 2700 分析仪和 贝克曼库尔特 Vi-CELL 分析仪在 3, 5,7,10, 12 和 14 天取样分 析其葡萄糖含量、 细胞密度和活细胞率。
杂交瘤细胞培养方法
DA4-4 杂交瘤细胞在添加 5% 胎牛血清和 1% 抗生素—青霉 素的 DMEM 培养基中生长。 每个 250 mL 锥形瓶用 45 mL 培 养基接种， 所有锥形瓶中培养基为同一批制备得来， 分别放置 在 New Brunswick S41i CO2 恒温摇床、 同类产品 1 和同类产 品 2 的六个不同位置。 锥形瓶在 37 °C， CO2 浓度为 5%， 空 气浓度为 95%， 转速为 95 RPM（2.52 rcf） 的条件下进行培养。 杂交瘤细胞在培养第 2 天和第 4 天分别传代接种细胞密度均为 2×105 cells/mL。 每个锥形瓶每日取样， 分别使用 YSI 2700 分析仪和贝克曼库尔特 Vi-CELL 分析仪分析其葡萄糖含量、 细 胞密度和细胞活性。
气体消耗量
New Brunswick S41i CO2 恒温摇床和同类产品 1、 同类产品 2 设置均为 37 °C， 转速 95 RPM， CO2 浓度 5%， 并确保该环 境已稳定运行12小时。CO2进气压力设置在厂商建议的最低值。 使用离线 CO2 分析仪验证每台摇床中 CO2 的浓度。 使用热质 量流量计记录每台摇床在 48 小时后所消耗的气体体积。 重复 试验三次， 平均结果如右所示：
结果
1) CHO 细胞及杂交瘤细胞的生长评估
图 1： New Brunswick S41i CO2 恒温摇床中培养 CHO 细胞的 平均活细胞密度和活细胞率
CHO 活细胞的最大活细胞密度在第七天达到了 4.72×106 cells/mL。 细胞率于前五天维持在 98%， 随后即缓慢下降 ( 如 图 1 所示 )。
图 2： 在 New Brunswick S41i CO2 恒温摇床、 同类产品 1 和 同类产品 2 中， 杂交瘤细胞平均活细胞密度的比较
与 CHO 细胞相比， 杂交瘤细胞在第二天和第四天指数生长期 细胞进行传代， 因此在前六天培养可维持 95% 的活细胞率。 最大活细胞密度在培养第六天达到 1.81×106 cells/mL（如图 2 和图 3 所示）
图 3： 在 New Brunswick S41i CO2 恒温摇床、 同类产品 1 和 同类产品 2 中， 杂交瘤细胞平均活细胞率的比较
2） 气体消耗量的测定
当 CO2 浓度设定在 5% 时， 对 CO2 消耗量的测定显示在相同 时间内， 其他同类产品比 New Brunswick S41i CO2 恒温摇床 消耗更多的 CO2 气体。 （如图 4 所示）
图 4： 24 小时内每台摇床平均 CO2 气体消耗量（标准升）
讨论和结论
在 New Brunswick S41i CO2 恒温摇床研发过程中， 我们已考 量到客户对环保型产品及追求产品更佳性能的需求日益高涨。 本研究通过培养两种在研究和生产中常见的细胞株验证了内部 带有 New Brunswick 摇床的新型 CO2 培养箱的性能。 该实验 并未对培养过程和培养基进行优化。
实验结果显示 New Brunswick S41i CO2 恒温摇床能降低环境 影响至最小程度， 并有效培养哺乳动物细胞。 New Brunswick S41i CO2 恒温摇床拥有四个偏心驱动， 为悬浮细胞的生长提供 精确及稳定的环境。
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