Fluidigm公司于2006年底推出了基于集成流体通路(IFC)芯片的Bio-Mark™ 高通量基因剖析系统。
其创新在于集成液体通路技术:应用集成电路制造工艺(光刻)在硅片或石英玻璃上刻上许多微管和微腔体,经过不同的控制阀门控制溶液在其中的活动来完成生物样品的分液、混合、PCR扩增。
图8. Bio -Mark™ IFC芯片
六.dPCR的应用前景
6.1 痕量核酸检测
图 9. 痕量核酸检测的具体分类
dPCR尤其适合:对灵敏度要求非常高的核酸痕量分析研究;基质复杂样品中的核酸准确定量(如组织、体液、排泄物等样品)。
图10. 痕量核酸检测相关方法比较
6.1.1 癌症标志物稀有突变检测
在一份给定的样本中,相比于野生型DNA,癌症相关的突变序列比例较低,经常无法检测。而凭借其超高灵敏度,dPCR系统可以很容易地定量分析低至0.001%-0.0001%的突变频率。之前用任何方法都无法实现准确稳定检测的样本,现在可以使用dPCR轻松进行定量分析。
是否能够开发出有效的靶向治疗药物,与突变基因的检测密切相关。其中(1)携带药物作用突变位点的癌细胞百分比;(2)突变的特定等位基因是否可以被准确检测到,这两点都直接影响到靶向治疗是否有效。很显然,在肿瘤均质细胞内检测单一突变相对简单,但是如果在异质组织内,在仅存有少量突变存在的情况下,如何准确检测出突变/稀有变异,或者针对于同一种癌症中多种亚克隆的准确鉴定,对个性化医疗的发展是一个巨大的挑战。
案列1. 实现肺癌相关的表皮生长因子受体(EGFR)中T790M突变的检测,可以更好地评估抗酪氨酸激酶抑制剂的治疗。然而,由于其他技术检测灵敏度有限,无法在高背景EGFR野生型中可靠地检测到T790M突变。研究人员使用dPCR技术开发出精确度很高的检测方法,以准确定量T790M的浓度[1]。
图11. ddPCR可以用EGFR突变的肺癌患者的血浆中游离DNA(cfDNA)为样本,检测与EGFR敏感性和药物抗性相关的突变
6.1.2 致病微生物检测
精确的病毒载量分析对于阐释疾病病程,后续治疗及疗效评估是至关重要的。病毒载量的波动,即使只下降了非常低的水平,意义却是显著的。在对病原体的研究中,能否实现准确而可靠的病毒DNA或RNA定量分析,关系到实验的成败。
案列2. 研究人员比较了 qPCR 和 dPCR 方法检测临床样本中残留的人类免疫缺陷病毒(HIV),其中包括功能性治愈的HIV感染婴儿。研究人员发现,在检测百万个细胞内的 HIV DNA拷贝数时,相比于 qPCR,dPCR 的灵敏度提升了5倍;在检测病毒长末端重复序列时,dPCR比qPCR灵敏提升了20倍[2]。
案列3.
研究人员探索HBV血清学和ddPCR检测结果与肝细胞癌(HCC)临床分期和病症之间的关系中,ddPCR成功的克服了real-time
PCR(qPCR)在检测FFPE处理的肝癌患者组织样品中HBV DNA时,遇到的准确度、灵敏度和重复性不足的缺点。进而得出以下结论:
1、ddPCR的灵敏度和准确度比real-time PCR更高——131个待测样品中HBV DNA浓度范围为1.1~175.5
copies/ul; 2、即使是在24个血清学检测呈阴性的样本中也检测到了痕量的HBV DNA; 3、样品中HBV
DNA的含量与肝细胞癌(HCC)组织的临床分期一致;
4、ddPCR技术可以用于肝癌的早期无创诊断,病程监控,肝移植、化疗或免疫抑制的疗效评估[3]。
6.2 与新一代测序(NGS)的无缝对接
相对于NGS, dPCR可以富集待测序样品中的靶基因; dPCR还可以验证 / 精确定量测序结果。
图12. ddPCR和NGS的优势互补
案列4.
由于人间充质干细胞(MSC)在人体内的含量极低,所以目前应用于临床治疗的MSCs都来源于体外培养。研究人员分别对体外培养p1,p8和p13阶段(passage)的来源于人骨髓MSC采用全基因组测序(WGS)。WGS结果显示在p1和p8阶段的培养细胞中没有拷贝数变异(CNV)和非常低频的单核苷酸突变(SNV),但是p13阶段的SNCs数目显著增加,达到677个。采用ddPCR对WGS发现的8个非同义突变进行了确认,结果发现在未经培养的单核细胞内就含有极低频对应的突变(0.01%),在p1和p8阶段培养的MSC内其突变比例依然处于极低比例状态(0.1-1%),但是在p13培养的阶段对应突变的比例显著地上升到(17-36%)[4]。
6.3 基因表达分析
实时荧光定量PCR 常用于检测基因表达差异,但该方法一般只能检测出两倍或者更大的差异。而一些研究则需要检测低于两倍的表达变化。dPCR 的检测精度可达±10%甚至更高,能够分辨更小的差异。
dPCR尤其适合:基因相对表达变化差异较小(<2倍)的研究;低丰度基因或单细胞的表达分析,以及RNA编辑、等位基因差异表达等研究。
图13. 基因表达分析相关方法比较
6.4 拷贝数变异分析
图14. 拷贝数变异
拷贝数变异 (CNV) 分析的目的是确认目的序列的拷贝数是否偏离野生型序列,以及偏差多少。拷贝数变异与疾病(癌症)、代谢途径、生物种进化等关系密切。临床上,CNV可为具体治疗方案的制定与修正提供参考;农业及畜牧业,CNV可作为遗传育种的遗传标记。
传统实时荧光定量PCR平台提供了足够的分辨率,可以鉴别低拷贝数 (如0至5的拷贝数);但更高的拷贝数需要更精确的测量,以确定确切的拷贝数。dPCR尤其适用于更高拷贝数分析,检测精度超过±10%。
参考文献:
1. Oxnard G R, Paweletz C P, Kuang Y, et al. Noninvasive detection of response and resistance in EGFR-mutant lung cancer using quantitative next-generation genotyping of cell-free plasma DNA[J]. Clinical cancer research, 2014, 20(6): 1698-1705.
2. Persaud D, Gay H, Ziemniak C, et al. Absence of detectable HIV-1 viremia after treatment cessation in an infant[J]. New England Journal of Medicine, 2013, 369(19): 1828-1835.
3. Huang J T, Liu Y J, Wang J, et al. Next generation digital PCR measurement of hepatitis B virus copy number in formalin-fixed paraffin-embedded hepatocellular carcinoma tissue[J]. Clinical chemistry, 2015, 61(1): 290-296.
4. Cai J, Miao X, Li Y, et al. Whole-genome sequencing identifies genetic variances in culture-expanded human mesenchymal stem cells[J]. Stem cell reports, 2014, 3(2): 227-233.