题目：Histological, Physiological, and Comparative Proteomic Analyses Provide Insights into Leaf Rolling in Brassica napus
期刊：Journal of Proteome Research
影响因子：4.268
合作技术：iTRAQ
研究背景
叶片是大多数植物光合作用的主要器官，叶片发育影响作物产量和植物结构。适度的卷叶被认为是作物理想型育种的一个重要组成部分，它能够改变植物的结构，提高光合效率，延缓叶片衰老，减轻干旱、高温和高光等胁迫带来的损害。近年来，在拟南芥和水稻等物种中，已经分离出了卷曲叶片突变体，并对它们的分子机制进行了深入的研究。油菜作为世界上最重要的油料作物之一，虽然也发现了一些卷曲叶片的突变体，但是对于其作用机制仍有待进一步的研究。
本文作者主要利用iTRAQ定量蛋白质组学技术分析油菜卷叶突变株Bndcl1与野生株（WT）的差异蛋白，阐明了卷叶机理及其对植物的生理影响，有望促进油菜的理想株型育种。
研究内容及结果
1. 本研究中，作者选取了油菜卷叶突变株Bndcl1，首先经组织学对比发现，相比于野生株（WT），突变株（Bndcl1）幼苗期的叶片表型上比较紧凑（图 1A和B）。组织切片结果中发现Bndcl1叶绿体数目明显增多，特别是在海绵状的叶肉细胞中(图1C和D)。此外，作者发现，在Bndcl1突变体中，在远轴端韧皮部组织细胞较少，而在其叶脉以下的远轴端表皮细胞明显增大(图1E和F)。
图1.叶片的组织学分析
2. 为了评估卷曲叶片对Bndcl1突变株光合性能的影响，作者测定了Chl的含量、Chl荧光和气体交换参数。与野生株相比，Bndcl1株中的叶绿体数量、PSII和净光合速率的有效量子产量显著增加。
3. 活性氧(ROS)的生成在光合作用的光反应过程中是不可避免的，PSII极易受到光破坏的影响。光抑制的光合作用不可避免的损失会因ROS的产生而加剧，而ROS的产生会减慢PSII的修复。为了减少光氧化伤害，光合生物体已经进化出多种机制，而对抗氧化剂的上调是调节机制的一部分。因此，作者检测了Bndcl1和WT叶子的酶活性、脂质过氧化和ROS水平，发现在Bndcl1叶片中O2• − 和H2O2较低，由此说明其ROS水平也将明显降低(图2A和B)。此外，TBARS在突变株的低水平同样说明其膜脂过氧化的水平降低(图2C)。作者还检测比较了两者的SOD、POD和CAT酶活性，发现相比于WT株，在Bndcl1叶片中此酶活性显著增加。由此说明Bndcl1的光系统能更好的避免受到光氧化伤害。
图2. 野生株（WT）和突变株（Bndcl1）的叶子酶活性、脂质过氧化和ROS水平
4. 作者应用iTRAQ定量蛋白质组学技术研究Bndcl1与WT叶片蛋白质表达水平的差异，总共鉴定到5019个蛋白，差异蛋白有943个，其中发生上调的蛋白有451个，发生下调的蛋白有492个。作者对这些蛋白进行了GO、COG、KEGG等注释分析。通过对差异蛋白中发生上调和下调的蛋白分别进行GO分析并对比发现，在“细胞增殖”、“生物过程的调节”、“色素沉着”等功能方面，下调的蛋白数目要比上调的蛋白数多，具有抗氧化活性的功能的上调蛋白数目是下调蛋白数目的3倍多（图3）。COG分析表明，大多数下调蛋白参与翻译、核糖体结构和生物发生，而上调蛋白主要参与碳水化合物的运输和代谢、转录翻译后修饰、蛋白质的周转、分子伴侣和能量的产生和转化（图4）。KEGG 注释结果显示，尽管在“代谢途径”、“次生代谢产物的生物合成”和“淀粉和蔗糖代谢”中均有上调和下调的蛋白质参与，但在不同的途径中也涉及到不同差异蛋白质（图5）。
图3.差异表达蛋白的GO功能注释分析
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