P1噬菌体转导试剂盒使用说明

P1噬菌体转导试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

P1噬菌体转导试剂是一种旨在通过供体大肠杆菌制备具有部分细菌基因的噬菌体，感染特定受体大肠杆菌，获得细菌之间基因片段的转移，而获得遗传重组的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于通用型非特异性基因片段的转导。产品严格无菌，即到即用，性能稳定，转导效率高。

技术背景

噬菌体（bacteriophage或phage）是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物，并使其细胞裂解死亡的病毒，本世纪初在葡萄球菌和志贺菌中首先发现。噬菌体具有病毒的一些特性：个体微小，可以通过滤菌器；没有完整的细胞结构，主要由蛋白质构成的衣壳和包含于其中的核酸组成；只能在活的微生物细胞内复制增殖，是一种专性细胞内寄生的微生物。在含细菌的固体培养基上，噬菌体使细菌细胞裂解而形成的空斑，称为噬菌斑。每个空斑都是由一个噬菌体颗粒一再侵染、增殖、裂解所形成的，故可用于进行噬菌体的计数。由于噬菌体结构简单、基因数少，容易获得大量的突变体，因此是研究核酸以及核酸与蛋白质相互作用的重要工具，是分子生物学与基因工程的良好实验系统。P1噬菌体是一种针对大肠杆菌的通用型转导噬菌体，既可以包装（packaging），又能转导，成为微生物基因组非特异性基因片段（长达100kb）操作的标准化模型工具。 

产品内容

专养液（Reagent A） 毫升

溶解液（Reagent B）      毫升

普养液（Reagent C） 毫升

转导液（Reagent D） 毫升

强化液（Reagent E） 毫升

产品说明书         1份

保存方式

保存在4℃冰箱里；有效保证6月

用户自备

P1噬菌体：用于转导的噬菌体

供体/受体宿主细菌：用于噬菌体转导的目标

1.5毫升离心管：用于样品操作的容器

15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器

9cm直径细菌培养皿：用于受体细菌选择培养的容器

培养箱：用于细菌培养

恒温摇床：用于宿主细菌培养

微型台式离心机：用于样品操作

实验步骤

一、P1噬菌体制备

• 移取xx毫升专养液（Reagent A）到15毫升锥形离心管

• 加入50微升用户自备的过夜新鲜培养的供体宿主细菌（10⁸ 细菌/毫升）

• 放进37℃恒温摇床孵育45分钟，速度为220RPM

• 加入100微升用户自备的P1噬菌体（5 X 10⁹ PFU/毫升），混匀

• 放进37℃恒温摇床孵育3小时或直至细菌完全溶解，速度为220RPM（注意：光线下未见漂浮的颗粒碎片）

• 加入xx微升溶解液（Reagent B），混匀

• 放进37℃恒温摇床孵育5分钟，速度为220RPM

• 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为9200g

• 移取4毫升上清液到新的15毫升锥形离心管

• 放进4℃冰箱里保存或置于冰槽里备用
  

二、噬菌体转导

• 移取xx毫升普养液（Reagent C）到15毫升锥形离心管

• 加入5微升用户自备的受体宿主细菌（10⁸ 细菌/毫升）

• 放进37℃恒温摇床孵育过夜，速度为220RPM

• 移取1.5毫升菌液到新的1.5毫升离心管

• 放进微型台式离心机离心2分钟，速度为16000g

• 小心去掉上清液

• 加入xx微升转导液（Reagent D），混匀颗粒群

• 准备好4个1.5毫升离心管，标记为1至4号管

• 分别加入100微升上述制备的受体宿主细菌到每个离心管

• 移取xx微升上述制备的P1噬菌体到1号管，混匀

• 移取xx微升上述制备的P1噬菌体到2号管，混匀

• 移取xx微升上述制备的P1噬菌体到3号管，混匀

 室温下孵育30分钟

• 分别加入xx毫升强化液（Reagent E），混匀

• 放进37℃恒温摇床孵育1小时，速度为220RPM

• 放进微型台式离心机离心2分钟，速度为16000g

• 小心去掉上清液

• 加入xx微升普养液（Reagent C），混匀颗粒群

• 铺板在用户自备的90mm直径的琼脂糖选择细菌培养基上（注意：含有抗生素等选择培养基）

• 倒置细菌培养皿

• 放进37℃培养箱孵育16小时

• 观察和计数——对照组无菌落生长；P1噬菌体量越多，转导体细菌菌落越多

• 挑选1个独立的菌落

• 在用户自备的90mm直径的琼脂糖选择细菌培养基上划线分离

• 倒置细菌培养皿

• 放进37℃培养箱孵育16小时

• 重复实验步骤23至26一次

• 后续鉴定阳性转导体菌落：PCR扩增或测序
  

注意事项

• 本产品为20次操作

• 整个操作须无菌操作

• 使用时，切莫污染母液

• 通常使用P1virW3110噬菌体为佳

• 通常的宿主细菌含有遗传标记，便于筛选

• 本产品可以获得100至1000转导体菌落/毫升PI噬菌体

• 如果需要彻底去除残余菌体，获得不含宿主细菌的噬菌体原液，可以使用0.45微米孔径的过滤器过滤

• P1噬菌体制备后的效价鉴定，建议使用 P1噬菌体效价检测试剂盒——60091

• 选择培养基的抗生素参考剂量如下

• 本公司提供系列噬菌体实验产品

质量标准

• 本产品经鉴定无细菌污染

• 本产品经鉴定繁殖效价高