预处理法提取土壤DNA
实验试剂
1. TENP缓冲液:50 mM Tris,20 mM EDTA,100mM NaCl,1% PVPP,pH10
2. PBS缓冲液:137 mM NaCl,2.7 mM KCl,10 mM Na2HPO4,2 mM KH2PO4,pH7.4
3. DNA提取缓冲液: TrisBase 0.1M, EDTA 0.1M, NaCl 1.5M, CTAB 1%
4. 溶菌酶(10 mg/ml)
5. 蛋白酶K(20 mg/ml)
6. SDS (20%,m/V)
7. 氯仿:异戊醇(24:1)
实验步骤
1. 取1 g土壤,加入6 ml TENP缓冲液,涡旋震荡混匀10 min,12000 rpm离心5 min,弃上清,重复洗涤3次;
2. 土壤沉淀再加入6 ml PBS缓冲液,洗涤一次,弃上清;
3. 加入37 ℃预热的13.5 ml DNA提取缓冲液,再加入100 μl溶菌酶,50 μl蛋白酶K,水平摇床上225 rpm,37 ℃摇动30 min;
4. 再加入1.5 ml SDS,65 ℃水浴2 h,其间间隔20 min混匀一次;
5. 6000 g室温离心15 min,上清液转入新的离心管中;
6. 分别加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1),混匀,6000 g离心15 min,取上清,重复抽提一次;加入0.6倍体积的异丙醇,室温放置1 h;
7. 15000 rpm室温离心20 min,沉淀用70%乙醇清洗2次,风干;
8. 用100 μl无菌去离子水重新悬浮。