组织钙离子浓度比色法定量检测试剂盒使用说明

主要用途

组织钙离子浓度比色法定量检测试剂是一种旨在通过邻甲酚酞络合酮，在碱性条件下与钙离子反应产生紫蓝色复合物，在分光光度仪下通过吸光峰值的变化，即采用比色法来测定样品中总钙离子浓度的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种组织（动物、人体等）裂解萃取样品中总钙离子的浓度检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，检测敏感。

技术背景

钙是人体中的一种重要电介质和矿物质，占1150克。其中99％的钙以氟磷灰石钙（calcium fluorophosphate apatite）形式存在于骨组织中。非骨组织钙成分主要存在于细胞内。钙具有两种主要形式：一种是非弥散型蛋白结合钙，其构成约40％至50％的血清中的总钙含量；另一种为弥散型游离钙，其进一步分成具有活性的复合钙（complexed calcium）和离子钙（ionized calcium）。钙对神经肌肉兴奋性（neuromuscular excitability）、血液凝固、酶的激活、离子跨膜运输、释放神经传导介质、信使传导等方面起着重要作用。钙的检测包括沉淀法、EDTA鳌合滴定法、火焰光度法（flame photometry）、原子吸收分光光度法等技术，但容易受到钠、钾、磷酸盐、硫酸盐的干扰，或者受限于仪器的特殊的要求。邻甲酚酞络合酮（o-cresolphthalein complexone；CPC）比色法是一种稳定、简便、准确的钙检测技术。钙与邻甲酚酞络合酮，在碱性条件下反应产生紫蓝色复合物，在分光光度仪下通过吸光峰值的变化（波长570nm），来定量测定组织钙的总浓度。其反应系统为：

OH^-

  Ca^＋＋  +  o-cresolphthalein complexone   →    violet complex dye

产品内容

清理液（Reagent A）      60毫升

裂解液（Reagent B） 10毫升

缓冲液（Reagent C） 20毫升

反应液（Reagent D）     2.5毫升

标准液（Reagent E）     500微升

产品说明书     1份

保存方式

保存在4℃冰箱里；缓冲液（Reagent C）、反应液（Reagent D）和标准液（Reagent E）避免光照；有效保证6月

用户自备

15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器

1.5毫升离心管：用于标准样品配制和样品保存的容器

微型台式离心机：用于样品制备

比色皿：用于反应的容器

分光光度仪：用于比色分析

实验步骤

• 样品准备

• 手术取出动物组织，并秤重以确定组织重量 

• （选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管

• （选择步骤）加入适量的（500毫克组织需要3毫升）清理液（Reagent A）清洗1次

• 移入到一个液氮冻存管

• 即刻放进液氮罐过夜

• 次日从液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意：切莫使组织冻融）

• 放进一个15毫升锥形离心管

• 加入预冷的500微升裂解液（Reagent B） 

• 转移到预冷的1.5毫升离心管

• 强力涡旋震荡30秒，充分混匀

• 置于冰槽里孵育30分钟，期间每10分钟强力涡旋震荡30秒（注意：如需暂时停止，放进－70℃冰箱里储存备用）

• 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

• 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管

• 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）

• 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

• 测定准备

• 准备好上述制备的待测样品，置于冰槽里备用

• 设定好分光光度仪：波长570nm，并置零 

• 准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管

• 分别加入100微升缓冲液（Reagent C）到2至5号管

• 移取200微升标准液（Reagent E）到1号管，混匀

• 小心移取100微升1号管的标准液（Reagent E）到2号管，混匀

• 小心移取100微升2号管稀释的标准液（Reagent E）到3号管，混匀

• 小心移取100微升3号管稀释的标准液（Reagent E）到4号管，混匀

• 将1至5号管放进冰槽里备用，避免光照；标准管浓度见下表

三、比色测定

• 移取800微升缓冲液（Reagent C）到新的1毫升比色皿

• 加入100微升反应液（Reagent D）

• （选择步骤）放进分光光度仪，置零

• （选择步骤）取出比色皿

• 加入100微升上述配制的标准液或待测样品 

• 上下倾倒数次，混匀

• 室温下孵育5分钟，避免光照

• 即刻放进分光光度仪检测：获得吸光读数（OD）

• 构建标准曲线：纵座标（Y轴）为吸光单位（OD）；横座标（X轴）为标准钙浓度（毫摩尔/升）

• 根据标准曲线获得样品对应钙浓度 

• 计算样品实际钙浓度

【根据标准曲线获得样品对应钙浓度（毫摩尔/升） X 样品稀释倍数】＝毫摩尔/升

注意事项

• 本产品为25次操作，包括标准液

• 操作时，须戴手套

• 避免使用EDTA等处理样品

• 建议样品保存在－70℃冰箱里

• 系统操作过程中，标准液测定只需1次

• 孵育反应完成后即刻进行比色测定

• 如果样本钙离子过低，可以增加孵育时间至30分钟

• 比色测定后，比色皿须清洗彻底

• 如果用户没有匹配的滤波器，可以使用570nm至600nm之间的任一波长

• 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度

• 检测范围在5微摩尔/升至0.5毫摩尔/升钙浓度范围：参考标准曲线如下

• 如果用户需要检测1至4毫摩尔/升钙浓度，请购买相应的标准液即可

• 本公司提供系列钙生化检测试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定

• 本产品经鉴定检测敏感