化学发光在磁性分离上不可忽视的问题（一）

生物磁分离在免疫化学发光（CLIA）IVD试剂盒研发生产时的5个关键性误区

化学发光免疫分析(Chemiluminescent immunoassay,CLIA)将高灵敏的化学发光技术与高特异性的免疫反应结合起来，建立了化学发光免疫分析法。CLIA具有灵敏度高、特异性强、线性范围宽、操作简便、使用成本低等特点。CLIA应用范围较广，既可检测不同分子大小的抗原、半抗原和抗体，又可用于核酸探针的检测。由于其优势，基于这一技术体外诊断测试的数量与日俱增。而每当一个化学发光分析仪安装在医院或诊断实验室后，其对应试剂盒的需求将可能达到一天数千套的用量。
 
因此，CLIA IVD试剂盒的需求量已开始飙升，但早期的小规模生产、纯人工操作和简略的质量控制手段已经无法应付大规模生产的需要。如何确保批次间的一致性；如何确保放大生产规模后质量的稳定性；如何确保成品最终应用的有效性（最终在分析仪中只使用不超过几百微升）都成CLIA IVD试剂盒生产的关键。在超过十年的发展阶段，我们发现了五个在生物磁性分离过程中的关键误区。这些误区容易被忽略但常常延误项目进度，造成重大的经济损失，有时甚至会使生产陷入风险。因此正确掌握磁性分离的技术信息是保证产品研发和生产成功的关键。

图1：新型生物磁分离系统

如何描述一个生物磁分离过程？

当一个新的CLIA-IVD试剂盒从研发阶段转移到生产阶段时，所有的生产操作参数都需要重新调整以适应新的产量和处理体积。生物标志物的规格，缓冲液和包被的操作都得益于非磁性试剂盒生产时所积累的经验。抗体与磁珠的偶联珠与胶体金或乳胶粒子很相似，但清洗环节的操作使用磁性分离这一方法与其他非CLIA-IVD试剂盒生产有很大区别。

虽然CLIA试剂盒在生产的分离阶段使用生物磁分离似乎是显而易见的选择，但在实践的过程中仍存在着一些问题。第一个是描述整个流程本身，当和IVD试剂盒制造企业沟通时发现在生物磁分离方面，他们经常提到如下几方面：

• 分离时间：从缓冲体系中分离固相的时间。

• 磁珠损耗：生产过程中丢失的磁珠（和偶联的生物标志物）的最大值。

• 批次处理体积：所需处理的批次大小，甚至一些情况下处理体积有弹性。

• 要避免不可逆的聚集: 在生产的过程中如发生不可逆的磁珠聚集需要采取多种方式使之重新悬浮，悬浮后必须检查是否处理得当。因为每一个试剂盒（毫升级别）都需要相同的性质，不正确的重悬浮处理会增大批次间的差异。

但是，以上这些都是“功能性”的参数，他们是磁性分离的结果而非影响分离过程的因素。在整个生物磁性分离的过程中，真正缺失但定义了整个分离过程的参数是什么呢？

在生物磁分离过程的关键参数是磁力。磁珠以特定的速度移动，这是由于磁力和阻力之间的竞争而产生的净力，后者是由缓冲液粘度引起的。

误区1：总归咎于磁珠不好

在选择磁珠是，用户很关心是否选择了“正确”的磁珠。假设已经选择好了合适的生物标志物和完美的耦联/包被方式，那么接下来用户选择“正确”的磁珠就应该具有如下一些特征：

1）高回收率/快速分离，匹配在分析设备中的时间，磁性分离速度足够快，在大规模生产过程中没有大量磁珠和耦合的生物标志物损失？

2）无聚集问题，磁珠可被轻松的重混悬浮。即使磁珠聚集可以通过几个额外的超声处理步骤进行处理就可恢复？（但这在大体积生产过程中难以控制和操作）

3）低批次间差异，每一批等分（通常小于毫升）和生产批次（升级别）必须一致。如果没有，差异会影响分析器给出的结果？
 
如果以上要求没有达到会如何？
对有缺陷的磁力分离结果，试剂盒生产企业最普遍的反应是磁珠的选择是“错误”的。然后生产企业联系磁珠供应商（或替代供应商）关于磁珠进行长期讨论，重审包被方法等，如果一旦陷入这个阶段，新产品的研发和推出将被严重影响，进度将大大延后。

生产企业应摆脱对“正确”和“错误”磁珠的纠结，而把重点关注放在对生物磁性分离设备和设备上。通过对比下图，我们可以发现同样悬浮的磁珠在不同生物磁性分离器的作用下会表现出完全不同的情况。

图2：采用两种磁铁分离相同的磁珠悬浮液

图2显示左边的传统磁力架（蓝色）处理的磁珠缓慢分离开。这意味着更长的时间才能完成分离或承受更高磁珠和生物标记物的损失。然而，如果等待较长的分离时间以避免损失，一些磁珠将受到不可逆的聚集问题的影响，因为先分离的磁珠（最接近瓶壁的位置）受到非常强的磁力将磁珠挤压在一起。如果在这一分离步骤，我们不考虑分离设备的影响，只从磁珠分离的表现来进行判断，那么我们将得到一个错误的结论：我们必须更换其它磁珠来解决问题。同时，从图2我们可以观察到，相同的磁珠悬浮液通过先进生物磁性分离设备（右边橙色）的结果我们可以看到分离情况却是完全不同的。磁珠在相同的速度下快速得到分离，同时由于均匀磁力，贴壁磁珠在更短的时间内受到温和磁力的作用，消除了不可逆的聚集风险。