5’末端DNA探针同位素（[γ32P]ATP）激酶标记试剂盒使用说明

主要用途

5’末端DNA探针同位素（[γ³²P]ATP）激酶标记试剂是一种旨在针对目标片段DNA、寡核苷酸引物、衔接体（LINKER）、线性载体等，使用多聚核苷酸激酶的正向反应，进行5’末端同位素标记处理的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其应用于后续杂交、测序、电泳标记、DNA连接反应、DNA修饰检测等实验。适用于各种粘性外凸或凹入、平滑末端等DNA分子的标记。产品即到即用，性能稳定，操作便捷，反应敏感，重复性好。

技术背景

源自于大肠杆菌重组的噬菌体T4 pseT基因的T4多聚核苷酸激酶（T4 polynucleotide kinase；T4 PNK）是多聚核苷酸5’羟基激酶，为同源四联体，分子量为28.9kD。催化ATP上的γ磷酸基团转移到单链或双链DNA分子上的羟基基团的正向反应（forward reaction）。

产品内容

缓冲液（Reagent A）   3毫升

反应液（Reagent B）       50微升

激酶液（Reagent C）       20微升

浓缩液（Reagent D）   1毫升

助沉液（Reagent E）  20微升

沉淀液（Reagent F）   5毫升

净化液（Reagent G）  15毫升

产品说明书       1份

保存方式

保存缓冲液（Reagent A）、浓缩液（Reagent D）、沉淀液（Reagent F）和净化液（Reagent G）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里；有效保证6月

用户自备

DNA片段：用于连接和克隆的目标DNA分子

[γ³²P]ATP同位素：用于同位素标记

1.5毫升离心管：用于样品反应操作和保存的容器

恒温水槽或培养箱：用于孵育或终止反应

震荡器：用于混匀反应物

4℃微型台式离心机：用于沉淀样品

液体闪烁计数器（liquid scintillation counter）：用于同位素活性测定

实验步骤

实验开始前，完成好目标DNA分子的去磷酸化和胶纯化等操作。并将恒温水槽打开，分别设置37℃和68℃。同时将－20℃保存的试剂，置于冰槽里融化.然后进行下列操作：

• 目标DNA分子标记

• 准备1个1.5毫升离心管

• 按照下表依次加入反应物：

• 涡旋震荡5秒

• 放进4℃微型台式离心机瞬时离心5秒

• 放进37℃恒温水槽孵育45分钟

• 放进68℃恒温水槽孵育20分钟

• 置于室温下，静置15分钟

标记DNA分子纯化

• 加入54微升缓冲液（Reagent A）

• 加入25微升浓缩液（Reagent H）

• 加入1微升助沉液（Reeagent I）

• 加入200微升沉淀液（Reagent J）

• 在涡旋震荡仪上震荡15秒，充分混匀

• 放进4℃微型台式离心机离心15分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）（注意：离心前做好方位标记，以便离心后观察管底沉淀颗粒）

• 小心移取上清液到新的1.5毫升离心管，标记为S1管（上清液）

• 加入700微升净化液（Reagent K）

• 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

• 小心移取上清液到上述S1管

• 空气中晾干沉淀颗粒群

• 加入50微升缓冲液（Reagent A），直至溶解，标记为D1管（DNA）

• 放进－20℃冰箱里保存或置于冰槽里备用

放射性活性测定

• 准备3个1.5毫升离心管，分别标记为：S2、D2和R（同位素母液）管

• 移取1微升上述S1管里的上清液到S2管（此为未整合CPM）

• 移取0.5微升上述D1管里的DNA悬液到D2管（此为整合CPM）

• 移取0.5微升同位素[γ³²P]ATP母液到R管（此为总CPM）

• 即刻放进液体闪烁计数器测定

• 获得CPM值

• 计算放射性特异活性（Specific Activity）和标记效率（Efficiency of Incorporation）

St＝实际CPM  X  500（稀释倍数）

Dt＝实际CPM  X  50（稀释倍数）

Rt＝实际CPM  X  2（稀释倍数）

标记效率％（Efficiency of Incorporation）＝（Dt÷Rt）X100％或【Dt÷（Dt＋St）】X100％

特异活性（Specific Activity）＝Dt÷0.5（微克，DNA量）

注意事项

• 本产品为20次操作

• 操作时，须戴手套

• 同位素操作须严格遵守规章制度

• 建议使用带滤芯的枪头进行分子操作

• 用户自备的目标DNA分子均须去磷酸化处理，例如小牛小肠碱性磷（calf intestinal alkaline phosphatase；CIAP），而未经去磷酸化处理的样品可以进行交互反应（exchange reaction），但效率欠佳

• 建议用户自备的目标DNA分子予以胶纯化处理

• 用户自备的目标DNA分子避免使用醋酸胺和高浓度NaCl等处理

• 同位素³²P标记的γATP，建议使用AMERSHAM（安玛西亚）公司

• 建议使用新鲜同位素材料

• 建议探针标记后即刻使用

• 建议使用螺旋盖的离心管制备同位素探针

• 标记探针可保存在－20℃冰箱里。其半衰期为28天

• 理想标记总活性为大于1 X 10⁸ CPM/微克DNA；整合效率为20至60％

• 本公司提供系列同位素处理试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定

• 本产品经鉴定不含污染性蛋白酶和核酶