用[α-32P] 3'脱氧腺苷5'-三磷酸或[α-32P]双脱氧ATP末端标记...

用[α-32P] 3'脱氧腺苷5'-三磷酸或[α-32P]双脱氧ATP末端标记双链DNA的3'突出端

实验材料 限制性内切核酸酶小牛胸腺末端转移酶模板 DNA

试剂、试剂盒 乙酸铵乙醇酚氯仿末端转移酶缓冲液

仪器、耗材 Sephadex G-50 离心柱

实验步骤

一、材料

1. 缓冲液和溶液

乙酸铵（10 mol/L )

乙醇

酚：氯仿（1:1，V/V)

2. 酶和缓冲液

适当的限制性内切核酸酶

小牛胸腺末端转移酶

5X 末端转移酶缓冲液

3. 核酸和核苷酸

模板 DNA ( 0.1~5 μg）

4. 放射性化合物

[α-32P] 3' 脱氧腺苷三磷酸（10 mCi/ml，比活性 5000 Ci/mmol)

或

[α-32P] 双脱氧 ATP ( 10 mCi/ml，3000 Ci/mmol)

5. 专用设备

Sephadex G-50 离心柱，用 TE ( pH 7.6) 平衡

二、方法

1. 用适当的限制性内切核酸酶消化 0.1~5 μg 模板 DNA。

2. 用酚：氯仿抽提及标准乙醇沉淀纯化 DNA。

3. 将消化的 DNA 溶于 10 μl 5X 末端转移酶缓冲液和 34 μl 水中。

4. 加入 5 μl 10 mCi/ml [α-32P] 3' 脱氧腺苷 5'-三磷酸（5000 Ci/mmol）或 [α-32P] 双脱氧 ATP ( 3000 Ci/mmol) 和 1 μl 牛胸腺末端转移酶（约 20 单位）。

5. 37℃ 温育反应 1 h。

6. 用 Sephadex G-50 离心柱层析或在 2.5 mol/L 乙酸铵的存在下进行两轮乙醇沉淀，以分离标记的 DNA 与未掺入的 [α-32P] 3' 脱氧腺苷 5'-三磷酸（或 [α-32P] 双脱氧 ATP）。