3.2 糖基化位点确定
ADC 单抗蛋白与其他单抗蛋白相同，也都包含 N-糖基化修饰，一般发生在保守序列 NXS 或 NXT 中（X 为除脯氨酸外的任意氨基酸）。在糖链完整的情况下，直接进行 trypsin 酶解，我们在搜库时进行 G0F 糖基化可变修饰设定，可以直接获得该 N 糖基化位点：重链氨基酸序列 EEQY N261STYR 中的 N261 位点，下图为该肽段的 G0F 串级质谱图，除了图中黄色和蓝色代表的该肽段的 b、y 碎片离子外，红色圆圈所示的为该糖肽的糖特征碎片离子（低 m/z 端）和糖肽碎片离子（高 m/z 端），从而可以准确确证该糖肽和糖基化位点的存在。
图 7. 重链氨基酸序列 EEQYN261STYR 的串级质谱图
3.3 ADC 药物结合位点确定
根据 Proteome Discovery 软件搜库结果显示，我们发现在赖氨酸结合药物分子的肽段的串级质谱图中存在特征碎片离子 453.20、485.23 和 547.21，因此我们通过这些特征碎片对所有的可能发生 ADC 结合的肽段的串级质谱图进行人工确认，最终准确确认了轻链中 2 个赖氨酸位点和重链中 7 个赖氨酸位点发生了 ADC 小分子药物结合，具体位点如下图（图 8）所示，并且以其中一条肽段为例，给出了 ADC 结合肽段的串级质谱图（图 9），红色圈表示 ADC 特征碎片离子。同时我们也观察到 ADC 药物结合后的肽段的疏水性比较强，色谱流出比较靠后，这一现象完全符合理论推测。
图 8. ADC 药物小分子结合位点示意图
图 9. ADC 结合肽段 VSNKALPAPIEK 的串级质谱图
4. 结论
本文通过 Q-Exactive 质谱建立了 ADC 单抗药物的整体分子量测定、氨基酸序列鉴定、糖基化位点和 ADC 药物结合位点确认的分析方法，为 ADC 单抗药物研发分析和实时生产检测提供了高效、快速的分析平台。实验结果表明 Q-Exactive 串联质谱仪，凭借其超高的分辨率，超快的扫描速度，超高的质量精度、超低的灵敏度和超大的动态范围，极大地完善和推动了 ADC 单抗药物的鉴定分析。
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