高分辨质谱仪实现非变性状态ADCs 药物的分析（二）

2.3数据处理

采用Thermo Scientific^TM Protein Deconvolution 3.0对原始质谱图进行去卷积。

参数如下：

3实验结果

本实验通过直接进样方式，分别设置Orbitrap分辨率为17500，35000，70000， ADCs药物的原始质谱图如图3，ADCs药物的质谱峰主要分布在m/z 5000-7000范围内，具有理想的信噪比。选取两组质谱峰进行放大（图4所示）可以发现，当逐渐提高质谱分辨率时，主峰逐渐与加合离子峰分离。分辨率越高，分离效果越明显。

经Protein Deconvolution 3.0软件去卷积处理之后的不同分辨率下的ADCs药物分子质量分布如图5所示，根据ADCs药物单抗的氨基酸序列和小分子药物的理论分子量进行计算，将观察到的质谱峰进行归属，从图中我们观察到，五个主峰呈现等质量间隔（约2635Da），由此可推断该单抗分子结合了不同数目的药物小分子。结合cysteine-linked ADCs的特点，判断主峰依次为结合了0、2、4、6、8个小分子药物的ADCs混合物，该结果与理论预期一致。

图3 不同分辨率设置下（17500，35000，70000）ADCs药物的原始质谱图

图4 不同分辨率设置下（17500，35000，70000）ADCs药物局部放大质谱图

图5 不同分辨率设置下（17500，35000，70000）ADCs药物去卷积后结果

表1不同分辨率（17500，35000，70000）下去卷积后的精确分子量和质量偏差

不同分辨率（17500，35000，70000）下去卷积后的精确分子量如表1所示，比较发现，当分辨率设置为17500时，由于无法实现主峰和加合离子峰的有效分离，质量与理论值偏差较大，最大偏差达到7.7Da。当分辨率逐渐提升到35000，主峰逐渐与加合离子峰分离，质量偏差控制在0.3-1.6Da，具有极佳的质量准确度。当分辨率逐渐进一步提升到70000时，主峰与加合离子峰分离度进一步提高，同样可获得理想的质量准确度（0.2-2.7Da），满足测定需求。

根据质谱峰的峰强度信息，可计算该药物的DAR值，该数值对于ADCs药物的有效性评估至关重要。以分辨率设置35000下质谱图去卷积结果为例（如图6所示），按照DAR = Σ(relative peak area×number of loaded drugs)/100计算DAR值，获知该ADCs药物DAR=3.9。

图6 分辨率设置35000下质谱图去卷积后ADCs药物质量分布图（D0-D8表示载有不同药物分子数的ADCs混合物）

4结论

本文采用Exactive Plus EMR质谱仪，直接进样方式，突破了传统的RPLC/MS平台无法进行cysteine-linked ADCs分析的瓶颈，建立了cysteine-linked ADCs的精确分子量测定方法，为cysteine-linked ADCs 单抗药物研发和生产检测提供了高效、快速的分析平台。实验结果表明Exactive Plus EMR质谱仪凭借其超高的分辨率、超快的扫描速度、超高的质量精度、超高的灵敏度以及拓展的质量范围，极大地完善和推动了ADCs药物的鉴定分析。

参考文献

1. Albert J R Heck et al. Nat. Methods 2008, 5(4), 927-933.

2. Sara Rosati et al. Nature Protocols 2014,9(4) , 967-976