引言
数据非依赖性的扫描模式（data-independent acquisition, DIA）是近几年来发展的一种新的质谱数据采集方式[1]。它的理念是用二级碎片离子进行蛋白相对/绝对定量。 DIA 扫描模式中，超高分辨质谱对特定质量范围内的所有母离子进行碎裂，采集所有母离子的碎片离子，并快速地依次扫描相邻的母离子宽口内的所有碎片离子。 DIA 的数据中包含了所有碎片离子的保留时间和强度信息。用非常小的质量偏差宽口（如 10 ppm）目标性地抽提同一肽段的多个子离子，计算子离子的强度，就能对该肽段进行鉴定和定量。 DIA 定量相比传统的基于母离子强度的 DDA 定量有选择性好，定量准确等优点[1]，所以 DIA 成为定量蛋白组学新的发展方向。
Q Exactive HF 是赛默飞世尔科技在 2014 年的 ASMS 上推出的全新静电场轨道阱超高分辨质谱仪（图 1）[2,3]。 Q Exactive HF 采用了分段式四极杆技术（Advanced Quadrupole Technology， AQT）使离子传输效率至少提高了 2 倍；超高场 Orbitrap 技术，提高了Orbitrap 扫描速度，在 15000 分辨率时，二级谱图的扫描速度是20 Hz。这两项技术提高了 QE HF 进行 DDA、 DIA 数据的采集能力。本文用 1 小时快速色谱梯度对 QE HF 的 DDA 鉴定能力和 DIA定量能力进行考察，同时从定量肽段数目和 CV 两方面对 DDA 定量和 DIA 定量能力进行比较。
实验条件
实验材料和方法
Pierce HeLa Protein Digest Standard（货号： 88329），稀释至500 ng/µl， EASY-nLC 进样 1µl， 500 ng进行 DDA、 DIA 数据采集，每种采集模式重复 3 遍。
高效液相色谱分离
高效液相色谱仪： EASY-nLC 1000 (Thermo ScientificTM)
分析柱：实验室自制 C18, 15 cm, ID 75 µm, 3 µm
流动相： A： 0.1% 甲酸水溶液； B： 0.1% 甲酸乙腈溶液
梯度： 60 min, 3/0 – 6/2 – 22/48 – 40/53 – 80/55 – 80/60（%B/min）
流速： 300 nL/min
质谱分析
DDA 数据采集：
质谱仪： Q Exactive HF (Thermo ScientificTM)；
离子源： NanoFlex 离子源；离子模式：正离子；
喷雾电压： 1.8 kV；毛细管温度： 275° C； S-Lens RF： 55%；
分辨率：一级 120000@m/z 200，二级 15000@m/z 200；一级
AGC： 3e6， Maximum IT： 50ms；
碰撞能量： NCE 27%； Fixed first mass: 110 m/z
DIA数据采集：
质谱仪： Q Exactive HF (Thermo ScientificTM)；
离子源： NanoFlex 离子源；离子模式：正离子；
喷雾电压： 1.8 kV；毛细管温度： 275℃； S-Lens RF： 55%；
目标 m/z 窗口： 400–1000； isolation window: 12Da；
碰撞能量： 27%； fixed first mass: 200 m/z； AGC target: 1e6；
Maximum ion injection time: atuo； loop count: 50
数据处理
Proteome Discoverer 蛋白鉴定流程：人蛋白数据库（uniprot human_201309），母离子质量偏差: 10 ppm；碎片离子质量偏差： 0.02 Da；固定修饰：半胱氨酸烷基化（+57.021 Da）；动态修饰：甲硫氨酸氧化（+15.995 Da）；天冬酰胺和谷氨酰胺脱氨基化（+0.984 Da）；酶： trypsin；漏切位点： 2； FDR< 0.01
Skyline DDA、 DIA 蛋白定量流程： DDA 定量用 skyline MS1 filtering 功能，对每个肽段强度最高的 3 个母离子同位素峰进行抽提， idotp ≥ 0.8； DIA 定量用 skyline DIA 功能，设置隔离窗口 12 Da，对给个肽段强度最高的 5 个子离子进行峰抽提， mProphet 打分，控制 FDR < 0.01。
实验结果
1. DIA 数据采集以及分析流程
图 1. DDA 定量和 DIA 定量实验流程
500 ng Hela 细胞裂解液进行 3 次 1 h 梯度 DDA 分析， Proteome Discoverer 1.4 数据库检索。将鉴定到的蛋白和肽段信息导入 skyline作为候选定量蛋白和肽段。基于母离子的定量用 skyline 中 MS1 filtering 功能对DDA 数据进行母离子强度抽提。 500 ng Hela 细胞裂解液进行 3 次目标 m/z 窗口 400–1000，隔离窗口 12 Da 的 DIA 分析。基于二级子离子的定量用 skyline DIA 功能对子离子进行峰抽提， mProphet 打分，筛选 Q value < 0.01 的肽段为定量肽段。
在分析 DIA 数据之前，需要建立谱图库，谱图库中包含所有蛋白在质谱中鉴定到的肽段，以及肽段的保留时间、碎片离子质荷比、碎片离子强度等信息。数据依赖性扫描是最好的建立谱图库的数据采集方式。 500 ng Hela 细胞裂解液进行三次DDA 数据采集。原始数据经 Proteome Discoverer 检索并控制FDR < 1%。将三次 DDA 鉴定结果合并，导入 skyline 建立谱图库。 DDA 数据除了能给出蛋白和肽段的鉴定信息，还能基于母离子的强度/峰面积进行定量。 Skyline 中 MS1 filtering 功能对母离子的多个同位素峰进行抽提，并且根据同位素分布进行打分（idotp 值）[4]。 Idotp 代表测定的同位分布和理论同位素分布的相似度。筛选 idotp 值大于 0.8 的母离子作为可信的定量肽段。
500 ng Hela 细胞裂解液用相同的色谱柱，相同的色谱梯度，将 QE HF 切换至 DIA 扫描模式进行 3 次 DIA 数据采集。在一次扫描循环中，目标母离子质核比范围 400–1000，四极杆的隔离窗口为 12 Da，包含 50 次 MS/MS 扫描。每一张 MS/MS谱图中包含了 12 Da 窗口内的所有母离子的碎片离子信息。 QEHF 使用了超高场的 Orbitrap，扫描速度是 20 Hz，所以每次循环所用的时间约为 2.4–3 s，与色谱兼容（图 2）。 Skyline 处理DIA 数据时从谱图库中选取强度最高的多个碎片离子进行色谱峰抽提。
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