引言
数据非依赖性的扫描模式(data-independent acquisition, DIA)是近几年来发展的一种新的质谱数据采集方式[1]。它的理念是用二级碎片离子进行蛋白相对/绝对定量。DIA 扫描模式中,超高分辨质谱对特定质量范围内的所有母离子进行碎裂,采集所有母离子的碎片离子,并快速地依次扫描相邻的母离子宽口内的所有碎片离子。DIA 的数据中包含了所有碎片离子的保留时间和强度信息。用非常小的质量偏差宽口(如 10 ppm)目标性地抽提同一肽段的多个子离子,计算子离子的强度,就能对该肽段进行鉴定和定量。DIA 定量相比传统的基于母离子强度的 DDA 定量有选择性好,定量准确等优点[1],所以 DIA 成为定量蛋白组学新的发展方向。
Q Exactive HF 是赛默飞世尔科技在 2014 年的 ASMS 上推出的全新静电场轨道阱超高分辨质谱仪(图 1)[2,3]。Q Exactive HF 采用了分段式四极杆技术(Advanced Quadrupole Technology,AQT)使离子传输效率至少提高了 2 倍;超高场 Orbitrap 技术,提高了 Orbitrap 扫描速度,在 15000 分辨率时,二级谱图的扫描速度是 20 Hz。这两项技术提高了 QE HF 进行 DDA、DIA 数据的采集能力。本文用 1 小时快速色谱梯度对 QE HF 的 DDA 鉴定能力和 DIA 定量能力进行考察,同时从定量肽段数目和 CV 两方面对 DDA 定量和 DIA 定量能力进行比较。
实验条件
实验材料和方法
Pierce HeLa Protein Digest Standard(货号:88329),稀释至 500 ng/μl,EASY-nLC 进样 1μl,500 ng进行 DDA、DIA 数据采集,每种采集模式重复 3 遍。
高效液相色谱分离
高效液相色谱仪:EASY-nLC 1000 (Thermo ScientificTM)
分析柱:实验室自制 C18, 15 cm, ID 75 μm, 3 μm
流动相:A: 0.1% 甲酸水溶液; B:0.1% 甲酸乙腈溶液
梯度:60 min, 3/0 – 6/2 – 22/48 – 40/53 – 80/55 – 80/60(%B/min)
流速:300 nL/min
质谱分析
DDA 数据采集:
质谱仪:Q Exactive HF (Thermo ScientificTM);
离子源:NanoFlex 离子源;离子模式:正离子;
喷雾电压:1.8 kV;毛细管温度:275℃;S-Lens RF:55%;
分辨率:一级 120000@m/z 200,二级 15000@m/z 200;一级 AGC:3e6,Maximum IT:50ms;
碰撞能量:NCE 27%;Fixed first mass: 110 m/z
DIA数据采集:
质谱仪:Q Exactive HF (Thermo ScientificTM);
离子源:NanoFlex 离子源;离子模式:正离子;
喷雾电压:1.8 kV;毛细管温度:275℃;S-Lens RF:55%;
目标 m/z 窗口:400–1000;isolation window: 12Da;
碰撞能量:27%;fixed first mass: 200 m/z;AGC target: 1e6;
Maximum ion injection time: atuo;loop count: 50
数据处理
Proteome Discoverer 蛋白鉴定流程:人蛋白数据库(uniprot human_201309),母离子质量偏差: 10 ppm;碎片离子质量
偏差:0.02 Da;固定修饰:半胱氨酸烷基化(+57.021 Da);动态修饰:甲硫氨酸氧化(+15.995 Da);天冬酰胺和谷氨酰胺脱氨基化(+0.984 Da);酶:trypsin;漏切位点:2;FDR < 0.01
Skyline DDA、DIA 蛋白定量流程:DDA 定量用 skyline MS1 filtering 功能,对每个肽段强度最高的 3 个母离子同位素峰进行抽提,idotp _ 0.8;DIA 定量用 skyline DIA 功能,设置隔离窗口 12 Da,对给个肽段强度最高的 5 个子离子进行峰抽提,mProphet 打分,控制 FDR < 0.01。
实验结果
1.DIA 数据采集以及分析流程
图 1. DDA 定量和 DIA 定量实验流程
500 ng Hela 细胞裂解液进行 3 次 1 h 梯度 DDA 分析,Proteome Discoverer 1.4 数据库检索。将鉴定到的蛋白和肽段信息导入 skyline 作为候选定量蛋白和肽段。基于母离子的定量用 skyline 中 MS1 filtering 功能对 DDA 数据进行母离子强度抽提。500 ng Hela 细胞裂解液进行 3 次目标 m/z 窗口 400–1000,隔离窗口 12 Da 的 DIA 分析。基于二级子离子的定量用 skyline DIA 功能对子离子进行峰抽提,mProphet 打分,筛选 Q value < 0.01 的肽段为定量肽段。
在分析 DIA 数据之前,需要建立谱图库,谱图库中包含所有蛋白在质谱中鉴定到的肽段,以及肽段的保留时间、碎片离子质荷比、碎片离子强度等信息。数据依赖性扫描是最好的建立谱图库的数据采集方式。500 ng Hela 细胞裂解液进行三次 DDA 数据采集。原始数据经 Proteome Discoverer 检索并控制 FDR < 1%。将三次 DDA 鉴定结果合并,导入 skyline 建立谱图库。DDA 数据除了能给出蛋白和肽段的鉴定信息,还能基于母离子的强度/峰面积进行定量。Skyline 中 MS1 filtering 功能对母离子的多个同位素峰进行抽提,并且根据同位素分布进行打分(idotp 值)[4]。Idotp 代表测定的同位分布和理论同位素分布的相似度。筛选 idotp 值大于 0.8 的母离子作为可信的定量肽段。