表 5. 单糖的化学组成和分子量
表 6. 用于计算表 4 和表 5 分子量的元素的单同位素原子量和平均原子量
最初的计算是根据发表在 DrugBank 数据库【2】的序列进行的，然而计算结果与我们实验测得的质量数并不匹配。通过将 DrugBank 中的序列与之前文献发表过的序列【3】进行比对，发现位于重链保守区域 219 位上的一个氨基酸不同，是丙氨酸而不是缬氨酸。 使用219 位为丙氨酸的序列的计算结果可以与完整蛋白质量数测定的结果以及先前报道的结果完全吻合【4】。为了进一步确认这点，我们进行了一系列的补充实验。
将抗体还原后（无烷基化），采用设置不同分辨率的方法分析已分离的轻链和重链，来观察在此分子量下能否实现同位素解析。由于轻链分子量较小，有可能得到同位素解析谱图，而重链无法得到，因为重链质量是轻链质量的两倍。若要采用不同的分辨率设置，方法设置分为两个阶段（从 0-15.8 min 分辨率设为 140 K，从 15.8-30min 分辨率设为 17.5 K）。通过优化梯度，实现轻链和重链的色谱峰完全分离。
在这项研究中，我们评价了两种整体柱（PepSwift 250 mm×0.2 mm 内径和ProSwift RP-10R 50 mm×0.1 mm 内径），轻链和重链两峰分离的保留时间之差均可大于 2 min（图 6）。分别对轻链和重链的质谱图（图 6b 和 6c）去卷积。轻链的同位素解析质谱图用 Xtract 算法去卷积，得到了单一同位素分子量23,025.3758 Da，与计算分子量只差 2.5 ppm。重链用 ReSpect 算法去卷积，产生三个峰，每一个峰代表一种主要的糖型，G0F，G1F 和 G2F（图 7）。
图 6. 还原型利妥昔抗体的色谱图（A），轻链的一级全扫描质谱图（B）和重链的一级全扫描质谱图（C）。
C 中的插图显示的是电荷态 z=+25 的放大图，三个峰代表三种不同的糖型。
图 7. 轻链和重链的去卷积结果。在分辨率 140,000 全扫描模式下获得轻链的质谱图，通过 Xtract 算法去卷积，得到准确的单同位素分子量和完整的同位素分布图（左图）。在 17,500 的分辨率下测得重链的质谱图，通过 ReSpect 算法去卷积，得到了平均分子量（右图）。
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