条件性恐惧和高架十字迷宫实验相关-Ｄ－丝氨酸对杏仁核区ＮＭＤＡ受体恐惧消退的作用
【摘要】 目的 探讨条件性恐惧与消退模型小鼠杏仁核区 Ｄ－丝氨酸代谢酶的变化及外源性 Ｄ－丝氨酸和ＮＭＤＡ 受体阻断剂 ＭＫ－８０１
对恐惧消退的影响及 Ｄ－丝氨酸抗焦虑作用的可能机制。 方法 （１）将 Ｃ５７ 小鼠随机分为空白对照组、条件性恐惧组、消退训练组、消退检测组，每组
６ 只，对照组不给予声音及电刺激，其余每组分别进行条件性恐惧、消退训练、消退检测等相应的实验步骤后取双侧杏仁核区组织提取蛋白进行
Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ 检测。（２）将 Ｃ５７ 小鼠随机分为 ３ 组：对照组（Ｆ）、Ｄ－丝氨酸组（Ｆ）、ＭＫ－８０１组（Ｆ），每组 ８
只，于消散训练前 １ ｈ分别腹腔注射生理盐水、Ｄ－丝氨酸 １０００ ｍｇ ／ ｋｇ 及ＭＫ － ８０１ ０畅 １ｍｇ／ ｋｇ。（３）Ｃ５７
小鼠随机分为 ３ 组：对照组（Ｘ）、Ｄ－丝氨酸组（Ｘ）、ＭＫ － ８０１ 组（Ｘ），每组 ８ 只，于消散训练前 １ ｈ
分别杏仁核区注射生理盐水、Ｄ－丝氨酸 ４μ ｇ ／ 侧、ＭＫ － ８０１ ０.１ μ ｇ／侧。（４）应用高架十字迷宫探讨 Ｄ
－丝氨酸对焦虑行为的影响。 结果 （１）与空白对照组比较，消退训练组及消退测试组杏仁核区丝氨酸消旋酶的表达下降，Ｄ
－氨基酸氧化酶表达上调。（２）Ｄ －丝氨酸组（Ｆ）木僵行为低于对照组（Ｆ），ＭＫ － ８０１ 组（Ｆ）高于对照组（Ｆ）及 Ｄ
－丝氨酸组（Ｆ）（P ＜ ０.０５）。 （３）Ｄ －丝氨酸组（Ｘ）的木僵行为少于对照组（Ｘ），ＭＫ － ８０１ 组（Ｘ）多于对照组（Ｘ）和 Ｄ
－丝氨酸组（Ｘ）（P ＜ ０.０５）。 （４）Ｄ －丝氨酸组小鼠在高架十字迷宫中开放臂时间百分比高于对照组（P ＜ ０.０５）。结论 Ｄ
－丝氨酸的抗焦虑作用很可能与激活杏仁核区 ＮＭＤＡ 受体促进恐惧记忆消退有关。
【关键词】 杏仁核；Ｄ－丝氨酸；恐惧消退
焦虑症是以广泛和持续性焦虑不安或反复发作的惊恐为主要特征精神心理性疾病。 恐惧消退受损是焦虑症状持续存在的主要原因。 ＮＭＤＡ 受体是谷氨酸受体的亚型，大量研究表明 ＮＭＤＡ 受体在恐惧消退中起着重要的调节作用。 Ｌ －丝氨酸在丝氨酸消旋酶（ｓｅｒｉｎｅ ｒａｃｅｍａｓｅ，ＳＲ）的作用下转化为 Ｄ －丝氨酸，Ｄ －氨基酸氧化酶（ Ｄ －ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ，ＤＡＡＯ）是 Ｄ －丝氨酸的主要代谢酶。 ２０１３ 年 ６ 月至 ２０１４ 年 ９ 月，本研究通过条件性恐惧与消退模型小鼠杏仁核区 Ｄ －丝氨酸代谢酶的变化及外源性 Ｄ －丝氨酸和 ＮＭＤＡ 受体阻断剂 ＭＫ － ８０１ 对恐惧消退的影响，研究 Ｄ －丝氨酸抗焦虑作用的可能机制。
１ 材料与方法
１．１ 实验药物 Ｄ －丝氨酸、ＭＫ － ８０１、ａｎｔｉ －ＳＲ ａｎｔｉ-ｂｏｄｙ、ａｎｔｉ －ＤＡＡＯ ａｎｔｉｂｏｄｙ、β－ａｃｔｉｎ、二抗均购买于Ｓｉｇｍａ 公司。
１．２ 实验动物及分组 Ｃ５７ＢＬ／ ６Ｊ 雄性小鼠（Ｃ５７）７２只，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供），９ ～１０ 周龄，体重
２０ ～２５ ｇ，饲养于标准环境（环境温度２４ ～ ２７℃，自由获得食物和水），光照周期 １２ ｈ。 （１）实验１：将 Ｃ５７ 小鼠随机分为 ４
组：空白对照组、条件性恐惧组、消退训练组、消退检测组，每组 ６ 只，空白对照组不给予声音及电刺激，其余每组分别进行相应的实验步骤按１.３
进行，结束后分别在模型后 １ ｈ 用取双侧杏仁核区组织提取蛋白进行 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 检测。 （２）实验 ２：将 Ｃ５７ 小鼠随机分为 ３
组：对照组（Ｆ）、Ｄ －丝氨酸组（Ｆ）、ＭＫ － ８０１ 组（Ｆ），每组 ８ 只，于消散训练前 １ｈ 给药，分别腹腔注射生理盐水、Ｄ －丝氨酸
１ ０００ ｍｇ／ｋｇ 及 ＭＫ－８０１ ０.１ ｍｇ ／ ｋｇ。 （３）实验 ３：将 Ｃ５７ 小鼠随机分为 ３ 组：对照组（Ｘ）、Ｄ
－丝氨酸组（Ｘ）、ＭＫ － ８０１组（Ｘ），每组 ８ 只，于消散训练前 １ｈ 给药，分别杏仁核区注射生理盐水、Ｄ－丝氨酸 ４ μ ｇ ／
侧、ＭＫ －８０１ ０.１μ ｇ／ 侧。
１．３ 条件性恐惧及消退训练模型的建立
实验装置为底边有导电的小铁柱有机塑料容器（由上海欣软信息科技有限公司提供，型号XR-XC404）。 第 １
天实验为恐惧学习记忆形成，将小鼠放入容器内适应 ３ ｍｉｎ。 然后连续进行 ４ 组训练，每组训练包括：３０ ｓ 的声音刺激（８０
ｄＢ），声音刺激的最后 ２ ｓ 给电流刺激（０.５ ｍＡ），每组间隔 ３０ ｓ。 第 ２
天为恐惧记忆消散训练，将小鼠放入另一个贴有黑白相间的纸条有机塑料容器内。 然后连续进行 ４ 组训练，每组训练包括：３０ ｓ 的声音刺激（８０
ｄＢ），间隔 ３０ ｓ。 第 ３ 天实验为恐惧记忆消散检测，容器及刺激与第 ２ 天相同。 观察小鼠的木僵行为。每只小鼠实验结束时，用
７０％乙醇清洗实验设备 。
１．４ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 检测杏仁核区组织提取蛋白 取小鼠断头，利用振荡切片机切冠状面脑片，厚度
４００ μ ｍ，置入事先通氧饱和的人工脑脊液中孵育 １ ～ １畅 ５ ｈ。 在体视显微镜下分离杏仁核装入 ＥＰ 管，提取蛋白，应用ＢＣＡ
法蛋白含量测定。 按 ３０ μ ｇ 蛋白量上样。
１．５ 杏仁核区安置套管１０％水合氯醛麻醉小鼠后，用立体定位仪固定头部。
以前囟为基点，按照杏仁核定位的脑区坐标 （ 前囟向后 １.５ ｍｍ，中线旁开 ３.４ｍｍ，向下 ３.５
ｍｍ），将针管按照定位坐标的深度插入到需要的脑区，固定针管并封闭，将其放入笼中休息４ ～ ５ ｄ。
１．６ 高架十字迷宫实验
在消退训练检测后 ３ ｈ 将小鼠放在迷宫的中央区。记录 ５ ｍｉｎ 内小鼠的运动情况，分析指标：进入开放臂时间／
总的时间。实验结束后，用７０％乙醇清洗高架十字迷宫仪器（实验仪器由上海欣软信息科技有限公司提供，型号：XR-XG201）。
１．７ 统计学方法 采用 ＳＰＳＳ １８.０ 统计软件，行单因素方差分析（ｏｎｅ －ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）。 两两比较采用 ＬＳＤ －t检验。
３ 讨论
焦虑症的最主要特点之一是恐惧记忆持久存在，难以遗忘。杏仁核是调节动物情绪的核心区域。大量研究表明，杏仁核在焦虑症的发生过程中起到决定性的作用。杏仁核参与恐惧记忆的形成、维持和消散。Ｄ－丝氨酸在一些哺乳动物脑区如海马、杏仁核等含量丰富。
研究表明，Ｄ－丝氨酸是内源性调节ＮＭＤＡ 受体重要的共激活分子。它可通过作用于ＮＭＤＡ受体甘氨酸结合位点增加 ＮＭＤＡ
受体活性，从而影响消退记忆。
有学者发现通过条件反射性恐惧训练的动物，其行为表现与焦虑症患者的症状相似，是研究焦虑及学习记忆经典的动物模型，高架十字迷宫是进行焦虑研究的新方法，结果可靠。通过研究条件性恐惧及消退小鼠杏仁核区
Ｄ－丝氨酸代谢酶的变化，可间接了解杏仁核区Ｄ－丝氨酸浓度变化。本实验发现，消退训练组（第 ２ 天）及消退测试组（第 ３ 天）小鼠杏仁核区 ＳＲ
的表达均下降，ＤＡＡＯ 水平升高，表明恐惧记忆的形成影响杏仁核Ｄ－丝氨酸代谢变化。但条件性恐惧组（第 １ 天）小鼠杏仁核区ＳＲ
的表达与对照组比较差异无统计学意义，可能与早期恐惧记忆尚未影响杏仁核区 ＳＲ 的蛋白合成有关。
恐惧消退受损是焦虑症状持续存在的主要原因，促进恐惧记忆消散是药物研究的重要靶点。因此，我们研究 Ｄ－丝氨酸抗焦虑作用是否是通过激活 ＮＭＤＡ受体促进恐惧记忆消散来实现的。 通过腹腔注射外源性 Ｄ－丝氨酸或 ＮＭＤＡ 受体阻断，应用恐惧消退测试、高架十字迷宫观察小鼠恐惧消退或焦虑行为的变化，研究发现腹腔注射外源性 Ｄ－丝氨酸鼠木僵行为显著少于对照组，而腹腔注射 ＭＫ－８０１ 阻断剂鼠的木僵行为高于对照组。在高架十字迷宫中，Ｄ－丝氨酸组进入开放臂的时间百分比高于对照组，而 ＭＫ－８０１组进入开放臂的时间百分比低于对照组。上述研究结果表明，Ｄ－丝氨酸可以促进恐惧消退，且其抗焦虑作用是通过激活 ＮＭＤＡ 受体促进恐惧记忆消退来实现的。
近些年的研究显示杏仁核参与调控恐惧记忆的形成、巩固和消散，因此，我们进一步研究 Ｄ－丝氨酸抗焦虑作用是否是通过激活杏仁核区的 ＮＭＤＡ 受体来实现。通过杏仁核区立体定位安置套管，微量注射外源性 Ｄ－丝氨酸或者 ＮＭＤＡ 受体阻断 ＭＫ－８０１，应用恐惧消退测试观察小鼠恐惧消退或焦虑行为的变化。研究发现杏仁核区微量注射外源性 Ｄ －丝氨酸组的木僵行为均少于对照组，而 ＮＭＤＡ 受体阻断剂 ＭＫ－８０１组的木僵行为高于对照组。 表明 Ｄ－丝氨酸抗焦虑作用与激活杏仁核区 ＮＭＤＡ 受体促进恐惧记忆消退有关。
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