5.Helicos
企业: Helicos Biosciences
推出时间: 2008年
主流型号: HeliScope™ Single Molecule Sequencer（2008年推出）
样品要求: 1-3 μg，起始DNA体积不超过100 μL.
测序原理: 边合成边测序,可逆阻断测序
待测DNA被随机打断成小片段，在每个小片段（~200 bp）的末端加上poly-dA，并于玻璃芯片上随机固定多个poly-dT引物，其末端皆带有荧光标记，以利于精确定位。首先，将小片段DNA模板与检测芯片上的poly-dT引物进行杂交并精确定位，然后逐一加入荧光标记的末端终止子。这个终止子与Illumina的终止子可不一样，不是四色的，是单色的，也就是说所有终止子都标有同一种染料。在掺入了单个荧光标记的核苷酸后，洗涤，单色成像，之后切开荧光染料和抑制基团，洗涤，加帽，允许下一个核苷酸的掺入。通过掺入、检测和切除的反复循环，即可实时读取大量序列。最后以软件系统辅助，可分析出完整的核酸序列。
文库制备: Fragment, Mate-pair
模板制备: 单分子检测
读长: 25-55 bp，平均35 bp
测序通量: 21 to 35 Gb/run
时间/run: 8 days
碱基精确度: >20X覆盖度时一致性超过99.995%
变异检测能力(DNA重测序方面): SNP, CNV
成本: 仪器$999,000/台，测序$0.45-0.60/Megabase.
数据格式: Raw data：srf或者sms格式
分析软件: 推荐用Helisphere开放资源软件进行过滤比对
优点: 真正的单分子测序，无需前期扩增，不引入偏向性;特别适合RNA-Seq或RNA直接测序的应用，因为它能直接测序RNA模板，而无需将其转化成cDNA。检测碱基替换突变的误差率非常低，~0.2%。
缺点: 错误率高，Insertion 1.5%，Deletion 3.0%；Heliscope在面对同聚物时也会遇到一些困难，但可以通过二次测序提高准确度；由于在合成中可能掺有未标记的碱基，因此其最主要的错误来源是缺失。
经典案例: 1.Single-molecule sequencing of an individual human genome.
Dmitry Pushkarev,Norma F Neff & Stephen R Quake.Nat Biotechnol, 27. (9): 847-852.
(更多详见http://www.helicosbio.com/HeliSp ... id/169/Default.aspx)
备注: 特别适合RNA-Seq或RNA直接测序的应用
6.DNA Nanoball array
企业: Pacific Biosciences
推出时间: 2009年底Science论文发表,2010年推出
主流型号: DNA Nanoball array
样品要求: DNA 由
PicoGreen定量：推荐10ug，最少7.5ug。浓度:75-150ng/ul;体积：50-200ul;DNA长度：大分子量双链基因组DNA，大部分超过20kb.
测序原理: 边连接边测序
采用了高密度DNA（玻璃板）纳米芯片技术和非连续、非连锁联合探针锚定连接（cPAL）技术来进行测序。基因组随机打断成500bp随机长度的片段，两端接上接头，成环，限制性内切酶酶切，重复2次，最终连接成一个DNA环，现阶段4接头建库方法能够支持70bp单端测序（35bp双端测序）。接着，所示，每个DNA环在反应液中高速扩增，形成一个纳米球（DNB），这样每一个DNA环大约扩增了200次。然后把这些纳米球平铺到预先处理过的玻璃板上，形成纳米芯片。最后通过非连锁联合探针锚定连接（cPAL）技术进行测序，10bp长的探针上有一个锚定碱基（A or T or G or C），其他位置都是N，通过与模板的杂交连接反应，根据4种不同的碱基（A/T/G/C）会有四种不同的荧光信号，总共需要40种不同的锚定探针。每一种锚定探针杂交之后都会进行洗脱。通过DNB芯片的荧光显影结果及解码分析，我们可以确定每个DNB的核酸序列。
文库制备: 500bp
模板制备: 纳米球（DNB）
读长: 35PE
测序通量: 20-60G/run/flow slide,共18 个flow slide
时间/run: 9 days
碱基精确度: 99.999%
变异检测能力(DNA重测序方面): SNP、Indel、SV、CNV
成本: 只提供测序服务，不出售仪器。09年11月的WGS成本为$1726 （45×），$8005 （87×）
数据格式: 基础文本格式，*.tsv。可交付结果包括：序列变异、功能注释、数据总结报告 及一整套上述结果的支持数据。
数据由三部分组成，主要部分是reads和mappings，其次是assambly 和variations，summary report最少
分析软件: Genome comparison tools、Format conversion tools、Annotation tools、Reference tools，在开发中的还有用于癌症基因组分析的肿瘤-正常样本比对工具和用于家族基因组分析的工具，还有大规模比对工具可以同时比对数百个基因组。Complete Genomics Assembly Pipeline version 1.5.0
优点: 测序自动化，成本低，通量大
缺点: 读长短，分析软件不公开，样品要求高
经典案例: Identification by whole-genome resequencing of gene defect responsible for severe hypercholesterolemia. Jonathan Rios, et al. Human Molecular Genetics, Volume19, Issue22 Pp. 4313-4318.
Human Genome Sequencing Using Unchained Base Reads on Self-Assembling DNA Nanoarrays.Radoje Drmanac1,et al. Science, Vol. 327 no. 5961 pp. 78-81 .
Analysis of Genetic Inheritance in a Family Quartet by Whole-Genome Sequencing. Jared C. Roach,et al. Science, Vol. 328 no. 5978 pp. 636-639
The mutation spectrum revealed by paired genome sequences from a lung cancer patient.William Lee,et al.Nature ,Volume:465, Pages: 473–477
备注: mapping reads：40X/genome
首页
