7.The PacBio RS system
企业: Pacific Biosciences
推出时间: 2010年2月开始早期试用
主流型号: PacBio RS
样品要求: 1kb以下500ng，纯化的基因组 DNA, BACs, cDNA 文库 或PCR 产物
测序原理: 边合成边测序，single molecule, real-time, or SMRT™, technology
这项技术的核心在于使用了Zero-Mode Waveguide(ZMW)(零波段边界)。测序的平台上有几万个小井，单个DNA聚合酶和要测序的DNA链固定在每一个小井里。带有荧光标记的脱氧核苷酸(A,T,C,G)被加入到每个小井里。每一种脱氧核苷酸在激化后分别能放出不同波长的荧光。小井的底部开了一个非常小的孔，小到比探测激光的单个波长还要短。根据我们的常识，这个孔太小了，激光无法从井的底部穿过去，从而无法激发脱氧核苷酸上的荧光物质。应此，底部的显微镜检测到的是一片黑暗。但是我们知道光线是一种波，它会衍射，激光虽然不能完全穿过小孔照亮整个小井，但它能透过小孔而勉强照亮小孔附近很小的一个区域。而DNA聚合酶正好被固定在这个小区域。当有单个脱氧核苷酸加载在DNA聚合酶上形成新的化学键时，这个脱氧核苷酸上的荧光物质被激活而发光，从而被显微镜观测到。这种特定颜色的荧光只持续一小段时间，应为这个碱基在DNA链上合成之后，它的荧光基团就会被剪切掉，从而继续下一个碱基的合成。当DNA链合成结束之时也是DNA链测序完成之时。但DNA聚合酶的活性会在激光照射下逐渐减弱，不能无限长度的进行合成反应，因此DNA链的测序长度也是有限的。
文库制备: Fragment, Mate-pair (250bp-6kb)
模板制备: SMRTbell™ library, 无需常规扩增，1kb以下的文库只需要500ng样品
读长: 1000bp
测序通量: 高灵活性的测序通量
时间/run: 模板制备到 primary basecall analysis只需不到一天,一般只需要不到4个小时.
碱基精确度: 准确率社会评价不高，2011年1月发表的NEJM杂志（关于海地霍乱的测序）在其supplementary提到它的单碱基准确率只有81-83%。
关于其准确率的社会评价不好，有网站称其准确度很差，单次测序平均错误率15%，循环测序后降至8%
变异检测能力(DNA重测序方面): SNP、Indel、SV、CNV，可以直接进行甲基化等修饰测序，方便表观研究
成本: $700,000 per machine，$99 per SMRTTMCell, each patterned with 15,000ZMW, each ZMW contain a single DNA polymerase.
数据格式: bas.h5 – Base File and Filtered Bases File - Documentation
cmp.h5 – Reference Mapped File and Consensus File - Documentation
分析软件: mapping：BLASR (Basic Linear Alignment with Successive Refinement)；组装：ALLORA (A Long Read Assembler)；SNP 和Indel ： RCCS (Reference Circular Consensus Sequencing) 客户端软件：SMRT Portal；提供：experiment specific, data-rich reports in industry-standard output formats containing both primary and secondary analysis data。可以使用第三方软件。
优点: 读长长；无需PCR扩增，也避免了由此带来的bias；需要的样品量很少；样品制备时间花费少；用RS系统可以远程快速获取数据和选择测序参数；通量灵活；时间快
缺点: 准确性低，需要循环测序，
经典案例: The Origin of the Haitian Cholera Outbreak StrainChen-Shan Chin,et al.N Engl J Med 2011; 364:33-42January 6, 2011.
Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules.John Eid, et al.Science 2 January 2009:
Vol. 323 no. 5910 pp. 133-138
DOI: 10.1126/science.1162986
备注: 1.在样品制备好后，有一个run design的步骤，可以在客户电脑上用RS remote 软件来自主选择运行方式和后续的个性化分析服务，以及第一时间接受测序数据2.截止2011年5月份已正式发售了多台RS测序仪，其中包括美国国家生化防卫分析与对策中心（NBACC）和冷泉港实验室。
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