芎归汤有效组分抗东莨菪碱致痴呆模型学习记忆能力...二

1.5 方法 将水迷宫和跳台筛选训练合格的小鼠 80 只，雌雄各半，按体重随机分为正常对照组、模型对照组、芎归汤有效组分剂量 1 ～ 5 组及阳性药组。芎归汤有效组分剂量 1 ～ 5 组及阳性药组分别给予各自治疗药物，按照 25ml/kg 体积每天灌胃，空白对照子给予相同体积生理盐水，连续给药 30 天。

1.5.1 Morris 水迷宫实验 新购进的昆明种小鼠，稳定 3 天后，进行 Morris水迷宫筛选实验 2 次。小鼠进行水迷宫筛选前先将小鼠放在平台上 10 s，让其认知平台，然后将小鼠从平台对角象限头朝臂放入水中，观察其 2 min 内能否找到平台，能找到平台的纳入正式实验，不能找到平台的小鼠人为将其引导上平台停留 10 s，10 min 后进行第二次筛选实验，能找到的纳入正式实验，两次都不能找到平台的小鼠剔除出实验。将筛选合格的小鼠进行水迷宫训练实验，每天4 次，上午下午各 2 次，训练实验同筛选实验方法相同，如此连续训练 10 ～ 15 次，确保每只小鼠都能在规定的时间内找到平台。实验时，平台低于水面 1 cm，水温 25.0 ± 1.0℃ ，水中加入漂白剂，充分混匀，使水呈乳白色，实验期间迷宫外参照物保持不变。将小鼠分别由平台对角象限头朝桶臂放入水迷中，记录小鼠在 2 min 内寻找平台的时间( 潜伏期) 及经过平台次数，作为学习记忆能力的指标，找到平台后允许动物在平台上停留30 s; 如果小鼠在 120 s 内未找到平台，记为 120 s。测试过程中保持实验室内灯光、物品等空间参照物摆放位置不变，排除干扰因素。

1.5.2 跳台实验 将水迷宫筛选训练合格的小鼠分别放入跳台不同的反应箱内适应 3 min，让其认知环境，然后立即通以0.2mA电流，定时 5 min，将 5 min内能够认知平台并进行躲避电刺激的小鼠纳入正式实验。将不能认知平台的小鼠人工引导其跳上平台躲避电刺激，再次适应 3 min，进行第二次跳台实验筛选，将两次都不能找到平台并躲避电刺激的小鼠剔除出实验。将筛选合格的小鼠进行跳台训练实验，训练方法同筛选方法，如此连续训练 5 ～ 10 次。参照徐叔云经典的药理实验方法学中的跳台实验进行测试，分两天进行，第一天学习，第二天记忆。实验时，将小鼠放入反应箱内适应 3 min，然后立即通以0.2mA电流。动物受到电击，正常的反应是跳回平台以躲避伤害性刺激，多数动物可能再次或多次跳至铜栅上，受到电击后又迅速跳回平台。定时 5 min，分别记录这两天小鼠第一次跳下平台的时间( 潜伏期) 以及 5 min 内小鼠跳下平台受到电击的次数( 错误次数) 。

1.5.3 Morris 水迷宫及跳台实验 第 31 天给药后 30 min 除正常对照组外，腹腔注射东莨菪碱造模，给药剂量为 2 mg/kg，注射体积为 3． 0 ml/kg。造模30 min 后进行 Morris 水迷宫实验，观察记录各组小鼠在 2 min 之内的潜伏期及经过平台次数。第 32 ～ 33 天进行跳台学实验，给药方法及时间同上。其中第 32 天为跳台学习实验，第 33 天为跳台记忆实验，电流控制在0.2mA，定时5 min，分别记录这两天小鼠第一次跳下平台的时间( 潜伏期) 以及 5 min 内小鼠跳下平台受到电击的次数( 错误次数) 。综合分析其学习能力的差异性。

1.5.4 芎归汤药效 ED50计算 以东莨菪碱致痴呆模型 Morris水迷宫及跳台实验潜伏期为指标，按照药效改善大于 25% 的动物，记为阳性，用 Bliss 计算法，确定芎归汤的药效 ED50。药效改善率 =药物组潜伏期 － 模型对照组潜伏期模型对照组潜伏期× 100%( 药效改善率 ＞ 25% ，为有效，记为阳性)

3 讨论

通过对各组小鼠 Morris 水迷宫及跳台实验的比较分析，芎归汤各剂量组由高到低，学习记忆能力逐渐下降，呈现明显的剂量依赖性，剂量 1 组药理学效应最强。提示，芎归汤对抗东莨菪碱致痴呆小鼠学习记忆能力衰退具有一定的保护作用，其效应大小随着剂量的增高而增大，呈现明显的" 量-效" 关系。与模型对照组比较，芎归汤对东莨菪碱致痴呆小鼠 Morris 水迷宫实验学习记忆能力减退的改善在 10.92 ～ 43.68 g/kg 剂量范围内均有显著性差异，且呈现一定的剂量依赖性，其 ED50为 4.79g / kg; 芎归汤对东莨菪碱致痴呆小鼠跳台学习记忆能力减退的改善在 2.73 ～ 43.68 g/kg 剂量范围内均有显著性差异，且呈现一定的剂量依赖性，其 ED50为 2.70g/kg。表明，芎归汤在跳台实验中表现出的作用药效果要优于在水迷宫中的表现。

目前关于 AD 的发病机制研究众说纷纭，没有一种假说可以完全解释 AD 的发生发展。其中的胆碱能损伤假说是目前比较公认的主流学说之一，其认为乙酰胆碱是与学习和记忆相关的重要物质，而海马是学习记忆的重要解剖基础，发生 AD 时基底前脑区的胆碱能神经元丢失，造成乙酰胆碱的合成、储存、释放减少，从而导致以记忆和识别功能障碍为主的多种临床表现。根据胆碱能假说研制的东莨菪碱致痴呆模型所造成的记忆障碍形式与老年性健忘症非常相似，因而广泛用于动物实验中建立认知功能伤，用以验证药物的作用。而 Morris 水迷宫实验和跳台实验又是研究学习记忆能力的最主要的实验方法，因此，结合东莨菪碱致痴呆模型，应用 Morris 水迷宫和跳台法对药物进行药效学研究就成为抗痴呆药物的主流方法。但是，在实际实验操作中笔者发现，Morris 水迷宫实验和跳台实验均有其不足之处，如个体间的成绩差异巨大，动物的回避性反应差异较大，需要检测大量的动物等，因此在进行药效学实验室应综合运用多种行为学检测方法，综合整理分析，进行药效学评价，用以提高实验结论的准确性和说服力，为更加有效、精确地进行相关药物活性筛选和药效评价提供实验依据，从而加快中药药理学学科的发展和提高中药新药创制的水平。

因此，本次实验以 Morris 水迷宫和跳法方法，对芎归汤有效组分抗东莨菪碱致痴呆模型进行药效学" 量-效" 关系综合评价研究，分析芎归汤不同剂量组的行为学数据，发现，对抗东莨菪碱致痴呆小鼠学习记忆能力衰退具有一定的改善作用，呈现明显的剂量依赖。芎归汤不同剂量组在跳台实验中的学习记忆能力衰退效果要优于在 Morris 水迷宫中的效果，跳台药效 ED50要小于水迷宫中的 ED50。