如何使用M5 多功能微孔板读板机和IMAP® 荧光偏振检测平台进行激酶活性的分析？
介绍
蛋白激酶在调节许多细胞反应过程时起着核心的作用。近年来已经成为癌症和其它许多疾病药物重要的作用靶点。IMA P是Molecular
Devices 公司推出一种快速、非放射性的激酶检测技术，由于技术本身特点其非常适合用于进行试验优化和高通量的筛选。
IMAP检测技术基于的原理是磷酸根离子与表面固化有三价金属离子的纳米球颗粒的一种结合作用。当这种结合反应发生后，荧光标记的多肽分子的运动轨迹发生了改变，荧光标记复合物的荧光偏振值就会增加(See
Figure 1.)。因为是一种均相的，可忽视底物多肽序列的一种检测方法，所以可广泛的应用于多种激酶的检测。
当使用 IMAP技术进行试验优化和高通量的筛选时，SpectraMax
M5多功能微孔板读板机可作为其非常理想的、可靠的检测平台。SpectraMax
M5是一种基于光栅型单色器的多功能微孔板读板机，允许使用者针对不同的荧光染料分子随意选择不同的检测波长，而无需额外再选购滤光片配件。这篇应用文章详细的描述了在进行IMAP荧光偏振激酶试验时，如何使用SpectraMax
M5多功能微孔板读板机和 SoftMax® Pro
软件进行检测和分别对红色及绿色荧光底物来校正曲线。LCK是一种酪氨酸酶，在T细胞信号转导通路中发挥着非常关键作用，制备其稀释曲线。另外Akt1/PKBa，一种丝氨酸-苏氨酸激酶，参与磷脂酰肌醇激酶3的信号转导和细胞活力。通过十字孢碱抑制A
k t 1 / P K B a 的试验中， 计算FAM
和TAMRA分别标记的多肽底物在反应过程始中获得的Z'因子值，其结果与滤光片式多功能微孔板读板机上获得的结果相一致。
材料
IMAP快速筛选试剂盒( Molec ular Devices Cat. #R8125)
IMAP结合试剂
IMAP 结合缓冲液 A (5X)
IMAP结合缓冲液B (5X)
IMAP反应缓冲液（5X）
LCK激酶(Upstate Cat. #14-442)
标记FAM - p34cdc 2 多肽底物(Molecular Devices Cat. #R7157)
标记TAMRA - p34cdc 2多肽底物(Molecular Devices Cat. #R7309)
标记FAM-p34cdc2来源的磷酸化多肽校正试剂(Molecular Devices Cat.#R7271)
贮存在纯水中的50 mM Adenosine 5’triphosphate (ATP)(Sigma Cat. #A6559)
贮存在纯水中的100 mM DL-Dithiothreitol(DTT)(Sigma Cat. #D9779)
十字孢碱 (Staurosporine) Biomol Cat.#EI-156)
黑色聚苯乙烯材质的384孔板(Corning Cat. #3710)
预装有SoftMax Pro软件电脑及连接SpectraMax M5 多功能微孔板读板机(Molecular Devices)
方法
激酶反应
步骤1.在1xIMAP反应缓冲液中加入DTT，并使DTT得终浓度达到1mM(1:100稀释100mM的DTT贮存液)，得到完整的反应缓冲液(CRB)；
步骤2.在CRB中制备400nM(4x)的FAM或TAMRA标记的多肽底物(1:50稀释原20uM的多肽贮存液)；
步骤3.在CRB中制备20uM(4x)的ATP( 1 : 2 5 0 0稀释原50mM的ATP贮存液)；
步骤4.准备一份终浓度为4x的酶梯度稀释液。对于激酶抑制剂试验，使用恒定浓度的酶，并制备出一组十字孢碱或其它激酶抑制剂的梯度稀释液。
步骤5.
将下列试剂平行的加入4个复孔的激酶反应体系中：
5ul CRB或十字孢碱
5ul酶(对于没有添加酶的背景孔，加入5ul CRB作为替代)
5ul 20uM的ATP贮存液
5ul 400 nM的多肽贮存液
步骤6.室温孵育1到1.5小时。
校准标准品的制备
步骤1.在CRB中制备一份100nM的多肽贮存液(使用与激酶试验中相同的底物)；
步骤2. 在CRB中制备一份100nM的磷酸多肽贮存液(使用与激酶试验中相同的磷酸化底物)；
步骤3.如图表1所示将多肽和磷酸化多肽贮存液按照一定规律混合后，制备校正标准品。样品量足够4个复孔所需；
步骤4.各移出20ul校正标准品到4个复孔中，包括一组只有20ul CRB的空白背景样本。
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