前言

THP-1 是人外周血的单核细胞系，最初来源于急性单核细胞性白血病患者，常被用来体外研究巨噬细胞功能。 它通常属于悬浮细胞，当用 PMA 处理后可分化为贴壁生长的巨噬细胞。THP-1 能释放许多细胞因子，其中包括白细胞介素 -8(IL-8)，一种能被许多类型细胞分泌的、在调节急性炎症反应中发挥作用的细胞因子。IL-8 与许多分析物一样可以在 96 孔板中被 ELISA 检测定量。通常 ELISA 实验需要耗费 4 个小时，而在 Abcam 的 SimpleStepELISA 试剂盒帮助下实验时间可以缩短至90 分钟，节约了近三分之二的时间，并且无损实验的灵敏度和重复性 ( 图1 )。这里我们介绍了如何使用 hIL-8 SimpleStepELISA 试剂盒以及如何在 SpectraMax ABSPlus 微孔板读板机上使用 SoftMax Pro 软件预置的便捷程序来测定 IL-8 的含量。

优点

- 利用 SpectraMax ABS Plus 微孔板读板机和SimpleStep ELISA 试剂盒定量白细胞介素 -8利用 Abcam SimpleStep ELISA 试剂盒可将 ELISA 实验时间从 260 分钟减少到 90 分钟，无损实验的灵敏度和重复性
- 在 SpectraMax ABS Plus 微孔板读板机上，整块 ELISA 板的读板时间可减少到 5 秒
- SoftMax Pro 软件可自动计算样品浓度和绘制曲线

材料

- hIL-8 SimpleStep ELISA 试剂盒 (Abcamcat. #ab214030）
- THP-1 人外周血单核细胞 (ATCC cat.#TIB-202）
- THP-1培养基
- RPMI-1640培养基（ATCC cat. #30-2001）
- Benchmark胎牛血清（Gemini cat. #100-106）
- β-巯基乙醇（Sigma cat. #M6250-100mL）
- 青-链霉素 (10,000 U/mL)（ThermoFisher cat. #15140122)
- SpectraMax ABS Plus微孔板读板机（Molecular Devices cat. #ABS Plus

方法

准备 THP-1 细胞

96 孔板每孔中预先加入 2 万个悬浮的未分化的 THP-1 细胞，随后用2.5 ng/μL 的PMA 或 DMSO（阴性对照）37℃ 处理细胞 48 小时。处理时间结束后收集细胞上清 -80℃ 冻存直至 ELISA 检测。

ELISA

ELISA 实验前需融化样品，2000 g 离心10 分钟去除细胞碎片，上清液用试剂盒提供的稀释液按照 1:5，1:10 以及 1:50 比例稀释。按照试剂盒说明书配制好标准品后，将样品与标准品加入试剂盒提供的微孔板中。然后每孔加入抗体混合物，孔板密封好后放入摇床室温震荡 1 小时。1 小时后用 Wash Buffer PT 洗涤每孔 3 遍，然后加入底物 TMB，暗室内置于摇床上震荡 15 分钟显色。15 分钟后加入终止液终止反应，并于 SpectraMax ABS Plus 微孔板读板机上测定 450nm 处吸光度。这一过程可在 SoftMax Pro 软件预置的便捷程序中实现 ( 参见图 1 工作流程 )。

结果