结果
SoftMax Pro软件中预置的IMAP
荧光偏振模板会自动计算出水平偏振均值和垂直偏振均值(mP值)，总的荧光强度，标准方差和CV值。每一组试验样品的组群一栏中，模板会自动扣除背景样品的荧光偏振值，然后计算出最小偏振mP值。也可根据相应的校正曲线计算出样品磷酸化比率。(See
IMAP Application Note #4, “Developing calibration curves for IMAP”)
图表2显示了使用 FAM-p34cdc2多肽获得的一条LCK激酶的稀释度曲线。当用SpectraMax
M5微孔板读板机检测时，得出酶的浓度范围从0.04至3.5
units/ml，最小偏振值为303，同时Z'因子的值为0.87。图表3显示了使用Analyst
HT多功能读微孔板读板机检测相同孔时，荧光偏振值为336，Z'因子的值为0.95。两台仪器得到的EC50值均为0.5 units/ml。
如果使用非磷酸化和磷酸化的多肽样品作为质控分别做一条校正曲线，可以将荧光偏振值以百分比形式显示，得出其磷酸化程度。(See Figure 4.)首先建立一条新的曲线(软件默认名称为Graph#1)，分别使用荧光偏振值(mP值)相对磷酸化百分比(浓度)作为你的质控样品组绘制一条曲线。曲线默认名称为“Plot#1.”在校正标准品组栏里，新建一列后输入下面的公式，即：
InterpX(‘Plot#1@ Graph#1@IMAP FP_FAM’,AvgbkgsubmP)。并用‘IMAP FP_FAM’作为试验名称。
为了确定使用红色荧光染料进行IMAP激酶试验的效果，另一个LCK激酶稀释曲线结果的获得来源于TAMRA-p34cdc2多肽。(See
Figure 5.)使用SpectraMax M5微孔板读板机检测结果，酶的浓度范围是从0.04到3.5
units/ml，荧光偏振值(mP值)为258 ， 同时Z ' 因子的值为0.95 。在Figure 6中，相同的试验使用Analyst
HT微孔板读板机进行检测后，荧光偏振值(mP值)结果为270，同时Z'因子的值为0.93。两个读板机得到的EC50值都为0.4units/ml，与FAM标记的底物获得结果相一致。同样也建立了一条相关的校正曲线(See
Figure 7.)，TAMRA和FAM相近的结果也可以让用户利用红色荧光染料给我们带来的优势，即能够尽可能降低化合物产生的背景荧光。
总结
随着研究人员努力去探究激酶在细胞信号转导通路和各种疾病中扮演的角色，以及在许多疾病治疗中发挥的调节机制，他们越来越希望获得非放射性的、均相的检测方法，可用于试验优化和高通量药物的筛选。荧光偏振试验可提供一种均相的、高通量的方式来鉴定各种激酶的激活剂、抑制剂和底物。使用SpectraMax M5多功能微孔板读板机进行IMAP荧光偏振检测：获得的结果精确性高、重复好、Z'因子值高，双光栅型单色器系统方便使用者选择不同荧光染料标记的多肽底物进行试验优化，而无需额外的在选购滤光片。此外，无论是用绿色或者红色荧光染料标记的底物进行IMAP荧光偏振激酶试验，获得的结果都与使用滤光片型单色器的微孔板读板机上的检测值相一致。最后，SoftMax Pro软件上预设的IMAP 荧光偏振模板为荧光偏振数据的采集和分析提供了一种更为方便的方式，并且这些模板也可用于不同荧光染料分子的检测。
参考
1.IMAP Akt Assay Kit Product Insert(Molecular Devices product #R8058).
2.Developing calibration curves for IMAP(IMAP Application Note #4).
3.Zhang, J.H., Chung, T.D.Y., and Oldenburg,K.R. (1999). A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of highthroughput screening assays. J Biomol Screen 4 (2): 67-73.
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