在前面的文章（Soil molecular biology），围绕提取土壤样品DNA、RNA相关问题做了简单的引导介绍，比如PCR抑制因子、裂解注意事项等。今天将详细介绍土壤微生物DNA提取的细节，以及如何使用MO BIO PowerSoil® DNA Isolation Kit获得更好的提取效果。
鉴于细节内容篇幅较长，此文章将分成两个部分。第一部分着重介绍研磨均质使用的研磨珠、研磨设备和裂解缓冲液。第二部分介绍选择化学溶液以获得最好的DNA吸附绑定、清洗和抽提效果。
MO BIO实验室用于提取土壤DNA的试剂盒有好几种。而PowerSoil DNA Isolation Kit 是效果最好，最受欢迎的一个。因此，在下面文章了将主要针对它来讨论。此试剂盒采用了ZL的抑制因子去除技术（IRT技术）来去除多糖多酚等腐植质，使用了小型的离心过滤柱和微型离心机。
需要注意的是，不同土壤微生物含量和有机物含量差异很大，DNA得率也就有差别。得率不单单是由样品起始量来决定，来自同一块泥土不同土层深度的样品微生物含量、有机物组成也会大不同。
想保证每个样品得率一致很困难，因为每铲泥土可能含有不一样多的树叶、残骸、昆虫，甚至小石子、沙子。在MO BIO实验室里，我们通常要对土壤样品进行过筛，去掉大块，保证每个样品质地一致。如果样品的一致性对你的实验影响比较大，过筛是必须的。
这点很重要，加大样品起始量，并不总是意味着可以获得更多的DNA。因为太多的样品会吸收掉大部分裂解缓冲液，使得研磨效率骤降。加大样品起始量只能对个别类型土壤来说可行。PowerSoil DNA Kit 是小量提取试剂盒。如果你需要提取多于0.25g的土壤，MO BIO提供了像PowerMax® Soil DNA Kit这样提10g土壤的，RNA PowerSoil® Kit和配套的DNA Elution Accessory Kit一次提取2g土壤。
接下来，我们顺着DNA提取过程一步一步讲解。首先是裂解，尤其是机械法裂解。
步骤一：裂解:
获得高得率完整DNA需要强而有力的裂解。选择研磨珠种类以及机械研磨时间需要掌握一个平衡，使得在打开微生物细胞的同时尽量减少对DNA的剪切破损。使用研磨珠击打破碎若配合温度改变，可以强化裂解作用，对于坚硬的有机物和孢子等的裂解有很大帮助。
研磨珠类型：
适合裂解土壤微生物的研磨珠有很多种。研磨珠的类型，外形，大小都会影响到DNA的得率和完整性。
MO BIO偏向喜欢用大小不一、边缘锋利的石榴石研磨珠。就因为研磨珠大小不一，既可以打碎大块泥土，也可以照顾到小小的微生物细胞。石榴石质地较软，在使用高速珠磨研磨机的时候会崩裂成很多小块。许多客户为了加强提取真菌DNA的机械裂解力，而在FastPrep o或Precellys上使用，也能获得很好的效果。
高速强力珠磨设备长时间击打研磨，需要使用0.5mm或0.1mm玻璃研磨珠。虽然这类研磨珠会加重DNA破损，但是用于孢子类坚硬有机物的裂解是有帮助的。你也可以混合使用大小不一样的玻璃和石榴石做一个适合自己样品的研磨珠混搭。
研磨设备：
前面文章也提到过，涡旋仪研磨法是获得完整DNA最省钱的研磨方法。实验证明，配合我们的裂解缓冲液处理0.25g土壤样品，10min的涡旋时间是最合适的。延长涡旋时间并不能增加得率，反而让DNA破损增大。
Precellys 或 FastPrep也是个不错的选择，如果你的实验室有，并希望加强裂解效果。大多数客户提取细菌、真菌DNA的时候，把FastPrep调到5档，研磨45s到1min。FastPrep上的5档相当于Precellys的5200rpm。也有些客户喜欢用4档（相当于Precellys的5000rpm），每个样品15-30s，3~4个循环。由此可以看到，使用强力珠磨研磨设备，还需要根据手上样品的具体情况调整研磨方案。文章尾部列举了一些在FastPrep上使用MO BIO UltraClean Soil 或 PowerSoil Kits的相关文献，供参考。
裂解缓冲液:
另一个组成强力裂解力量崩开细胞的重要成分是"溶液"。这个溶液必须满足3个条件。第一，联合机械作用力瓦解细胞膜。二，性质柔和不损伤DNA。三，不受土壤本身pH的印象。必须缓冲掉土壤本身的酸性，因为酸性条件对DNA有害。裂解缓冲液结合C1或者S1（分别是PowerSoil 和UltraClean Soil kits）提供了裂解所有类型土壤微生物的最佳条件。
加热？
在需要强力裂解的情况下，撇开高速强力注珠磨研磨机和玻璃研磨珠不说，研磨前加热样品对于提取是有帮助的。接入裂解缓冲液以后，65℃-70℃孵育10-15min可以弱化细胞膜，利于研磨破碎。对真菌、孢子尤其有效。
另一个方法是从-20°C 或 -80°C 到 37°C对土壤样品反复冻融3次。此方法同样能增强细胞的破碎。当然，实施起来就没有上面提到的加热法方便。
总结:
好了，已经说了很多。总的来说，裂解步骤就是联合研磨珠+研磨设备+缓冲液仪器对样品进行裂解并极大程度上影响DNA的得率和完整性。各个环节都是很灵活的，你可以根据样品的实际情况做调整。而无论提取动物组织RNA、微生物纯培养DNA、生物薄膜（Biofilm）DNA或RNA，道理都是一样的。
还好，有MO BIO labs R & D科学家们花大量时间为做各种环境样品提取条件的优化，反过来就是节约了您宝贵的实验时间。
我们没办法尝试每一种土壤类型，那就需要您来告诉我们，为了获得最佳的裂解效果，您都做了些什么？使用哪种研磨珠、多长研磨时间、使用什么研磨设备、用了MO BIO的那个盒子？
下一篇文章里，我们将继续讨论土壤DNA提取中涉及的硅胶膜离心吸附柱。
谢谢你们的阅读！
配合高速珠磨研磨机使用MO BIO土壤试剂盒的相关文献:
Shifts in Microbial Community Composition and Physiological Profiles across a Gradient of Induced Soil DegradationGuilherme M. Chaer, Marcelo F. Fernandes, David D. Myrold, and Peter J. Bottomley Soil Sci. Soc. Am. J., Jun 2009; 73: 1327 – 1334.
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Community Structure in the Sediment of a Freshwater Stream with Variable Seasonal FlowSteven A. Wakelin, Matt J. Colloff, and Rai S. KookanaAppl. Envir. Microbiol., May 2008; 74: 2659 – 2668.
Changes in Bacterial and Archaeal Community Structure and Functional Diversity along a Geochemically Variable Soil ProfileColleen M. Hansel, Scott Fendorf, Phillip M. Jardine, and Christopher A. FrancisAppl. Envir. Microbiol., Mar 2008; 74: 1620 – 1633.
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Molecular Fingerprinting of the Fecal Microbiota of Children Raised According to Different LifestylesJohan Dicksved, Helen Floistrup, Anna Bergstrom, Magnus Rosenquist, Goran Pershagen, Annika Scheynius, Stefan Roos, Johan S. Alm, Lars Engstrand, Charlotte Braun-Fahrlander, Erika von Mutius, and Janet K. Jansson Appl. Envir. Microbiol., Apr 2007; 73: 2284 – 2289.http://aem.asm.org/cgi/reprint/73/7/2284
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