这周我们来讨论一项常用的技术，即使常用但仍引起部分人核酸分离焦虑症。那就是基因组DNA的纯化去杂质。
场景是这样的：你有一份采自南太平洋中部一个偏僻小岛上首次发现的古老兰花品种根际土壤样品。你使用了非PowerSoil Kit法提取其中的微生物DNA。最终DNA含有太多杂质，无法PCR扩增。因此需要去除腐植酸等PCR抑制因子。你需要所有的核酸分子通过全基因组鸟枪测序……怎么办？
你致电MO BIO说了你的大概情况，而我们推荐了使用PowerClean Kit。PowerClean是不带研磨珠套管的迷你版PowerSoil Kit。样品经过了IRT处理，重新洗脱得到干净的DNA。等等…分光光度计读数发生变化了！纯化前显示有300ng/μl的DNA，现在却只有30ng/μl。有比这更可怕的噩梦吗？你的DNA大量丢失了！
先别急。可以告诉你，你的DNA现在是安全并且干净的。使用实验室常规方法纯化DNA前后到底发生什么事，下面向你解释：
我想先回到之前写的一篇关于环境样品粗提DNA中杂质误导UV260得率检测结果的文章。这点非常关键，因为伴随土壤、水样、生物薄膜、植物组织等样品一起被提取出来的有机抑制因子会影响波长260测量DNA得率读数的准确性（也抑制PCR扩增）。如果采用CTAB法或苯酚氯仿法提取，降解的小分子RNA也会影响读数。没有使用抑制因子去除技术的硅胶离心柱型试剂盒、使用强力绑定盐溶液无差别地绑定吸附DNA和RNA等因素同样影响得率检测数据。
好消息是，一旦这些影响因素被去除，最新的读数才代表真正的得率
下面我们来看一下在实验室常规检测手段（分光光度法和琼脂凝胶电泳）下DNA的情况是如何被展示的。我们从分光光度法开始，下面展示了几个使用及未使用IRT技术提取的土壤样品结果。首先注意到的是DNA得率读数ng/ul。这个读数很重要，但也只是告诉你事实的一小部分。。
纵览整个表格
260/230比率告诉我们这个DNA有问题。读数低于1.0，表示含有高水平的抑制因子。我们还能从320读数中看到另一个重要的信息。与下列的样品相比，上面的样品读数高出10倍。腐殖酸在波长320吸光度最强，因此340处的高吸光度值表示最终DNA中含有大量腐殖酸。260/230比值，加上较高的320吸光度，表明DNA很不干净，且是由有机杂质引起的。
吸光光度法提供了所有波长下的数据。我们能清楚地看到在整个波段检测中杂质的情况。读数开始很高并持续放大。曲线的中部抑制因子集中的地方260读数一直高于正常位置。
但是，这还是很难让所有人相信，最终溶液中并不全是DNA。所以，最好的确认结果的办法是琼脂糖凝胶电泳。电泳图中有分光光度法无法看到的信息，DNA的完整性和直观的得率。现在我们看到的情况完全不一样。虽然分光光度法显示未使用IRT技术的DNA得率是使用了IRT技术得率的两倍，而电泳图上它却没有跑出相应多的DNA。杂质干扰了分析结果。这就是为什么我们常常建议同时用分光光度法和琼脂糖凝胶电泳或picogreen检测DNA。
那使用PowerClean Kit纯化粗提DNA过程中发生了什么事？你去除DNA中的杂质成分，结果得率读数下降了。有些时候读数能下降多达50%。但大分子DNA并没有损失。丢失的只是你不想要的杂质部分，讨厌的PCR抑制因子浪费你的时间和金钱。现在DNA总算干净了。
让我们再深入了解第二个误导DNA得率的东东：RNA
许多提取方法会把RNA连同DNA一起提取出来。虽然这部分RNA分子并不完整，但仍会吸收UV。使用苯酚和氯仿提取核酸，以及等份强绑定盐溶液、酒精吸附DNA法都会把RNA提出来。因为分光光度法并不能区分DNA和RNA。这就是为什么只检测DNA部分的Picogreen法结果会更准确。琼脂糖凝胶电泳能直观地看到RNA弥散带，对结果判断更有帮助。
在这个例子中我们提取了过夜孵育的大肠杆菌纯培养，每样4ml。从电泳图上能清晰看到底部弥散的降解RNA（条带4-6）。分光光度法和Picogreen读数对比结果列在了右边。Picogreen的结果显示，DNA的得率要比分光光度法读数低60%。有些样品RNA能推高读数高达70%。如此大的误差必定会对后续实验结果产生影响。
好消息是，MOBIO的试剂盒设计上只绑定DNA，不吸附RNA。从上图结果看来，确保了分光光度法读书的准确性。根据需要，通过调整绑定条件还能增加或减少小片段核酸或RNA的捕捉效率。
所以，总结最后：做纯化前后给DNA跑电泳。检查浓度（得率）和完整新（DNA分子量大小），并与备用检测方法（分光光度法或Picogreen）做对比检查是否存在RNA或抑制因子。
开展后续实验前对DNA样品做个简单的检查可节省你的时间，减缓焦虑情绪。请记住，试剂盒只能你给什么，他们出什么。你要的是干净的DNA。事先知道你有多少DNA，对最终出来的DNA有个大概估计，做到心中有数。
首页
