实验原理
1. 离心柱结构:特殊硅基质吸附材料,特异性吸附DNA,而RNA与蛋白质穿过。
在正常情况下,核酸表面覆盖了一层由水分子组成的亲水薄膜,以维持其水溶性。高浓度盐离子的加入破坏了核酸表面亲水薄膜的相对有序排列,形成了疏水环境。在此环境中,核酸与硅胶膜能有效结合,而蛋白质、代谢产物和其他污染物则不能结合。
2. 碱变性抽提的原理是在pH高于12.6的碱性条件下,染色体DNA的氢键断裂,破坏了碱基配对,导致双螺旋结构解开而变性,但闭环的质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当pH调至中性时,质粒DNA链迅速恢复到原来构型,仍保存于溶液中。而变性的染色体DNA不能再复性,通过离心,随不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来,使两者得以分离。
实验试剂
1. 试剂盒自带溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ
2. 漂洗液
3. 结合缓冲液
4. 洗脱缓冲液
5. TE buffer
实验设备
1. 吸附柱
2. 取液枪
3. 离心机
4. 低压电泳仪
5. 水平电泳槽
6. 紫外透射仪
实验材料
带有质粒的大肠杆菌
实验步骤
1. 培养细菌:将带有质粒的大肠杆菌接种到1.5-3ml含有相应抗生素的液体培养基,37℃培养12~16小时;
2. 取液体培养液3ml(1.5mlX2)于Eppendorf管中,10000r/min离心1min,去掉上清液,加入100ml 溶液I,充分混匀;置冰上;
3. 加入150ml 溶液II,加盖颠倒6-7次使之混匀,冰上放置1-2min;
4. 加入150 m l 溶液III,加盖后颠倒6-7次混匀,冰上放置5min;
5. 用台式高速离心机,12000r/min离心10min;
6. 吸附柱中加入420ul 结合缓冲液,将步骤5中的上清转移至吸附柱中,盖上收集管的盖子,混匀, 12000r/min离心1min;
7. 取下吸附柱,倒掉收集管中的液体,吸附柱放回同一收集管,向吸附柱中加入600ul 漂洗液 , 静置1 min,12000r/min离心30 s;
8. 重复步骤7一次;
9. 取下吸附柱,倒掉收集管中的液体,吸附柱放回同一收集管,12000r/min离心2min;
10. 吸附柱放入一个新的1.5ML离心管,在吸附柱的中央加40ul洗脱缓冲液或 TE buffer,室温放置3-5分钟。盖好盖子12000rpm 离心1分钟,收集质粒DNA溶液。
11. 取5ul 电泳检查,(100ml凝胶加入5ul 染料)。
注意事项
加样时要排出枪头中的空气,以免搅动液面。