用参照基因 ( 如GAPDH 或 ß-actin)能准确量化初始材料的载量,尤其当初始材料量常常受限时,进行相对基因表达分析实验十分方便。缺点是这个方法要求得到一个或多个在所有测试样本中恒定表达的已知参照基因，而且表达水平不受研究条件下处理方式的影响。确定这样的参照基因十分重要，最近有报道提出在大多数研究实验中，使用多个参照基因对于准确定量是必须的。(Vandesompeleet al., Genome Biology 3, research 0034.1–0034.11, 2002 )
用相对定量比较多个样本，样本之一常被选为参照。在其它所有样本中目标基因的表达都相对于参照上调或下调，通常用未处理的或基准样本作为校准样本。确定 CT 值之后，可以用不同的方法来确定实验样本相对于校准样本目标基因的相对表达水平，下面我们介绍三种用参照基因进行相对定量的方法：1) Livak 法，即众所周知的2–ΔΔCT法 2)用参照基因的 ΔCT 法 3 ) Pfaffl 法，每种方法都有优点和缺点，并且必须满足分析实验结果的前提条件。
进行相对基因表达分析普遍采用操作简便的2–ΔΔCT 法，条件是目标基因和参照基因扩增效率都接近 100% 且相互间效率偏差在5% 以内。使用2–ΔΔCT 法之前，必须验证目标基因和参照基因的扩增效率。一旦确定目标基因和参照基因有相似且接近 100% 的扩增效，你就可以确定不同样本中目标基因表达水平的相对差异，步骤如下：
首先，对所有的测试样和校准样本，用内参基因的 CT 值归一目标基因的CT 值：
ΔCT(test) = CT(target, test) – CT(ref,test)
ΔCT(calibrator) = CT(target,calibrator) – CT(ref, calibrator)
其次，用校准样本的 ΔCT 值归一试验样本的 ΔCT 值：
ΔΔCT = ΔCT(test) – ΔCT(calibrator)
最后，计算表达水平比率：
2–ΔΔCT = 表达量的比值
得到的结果是通过参照基因表达水平校准的试验样本中目标基因相对于校准样本的增加或减少的倍数，用参照基因校准目标基因表达的目的是弥补样本组织量的差异。如果目标和内参基因的扩增效率不相近，可以优化或重新设计实验，或者可以采用后面讲的Pfaffl 法。另外，如果目标基因和参照基因有同样的扩增效率，但是扩增效率不等于 2，那么2–ΔΔCT法的公式可以修正为用实际扩增效率值代替等式中的 2。例如，如果目标基因和参照基因的扩增效率都为 1.95，计算公式为1.95–ΔΔCT。
用参照基因的ΔCT 法是 Livak法的一种变化形式，它更容易掌握且结果相同，ΔCT 法用每个样本中参照基因与目标基因的 CT 值差异。虽然这种方法的操作步骤简单，但同样能真实衡量基因表达水平，将参照基因的表达水平计算在内。结果显示，主要的差异是校准样本的表达水平不是1.0。如果用这个方法得到的表达值除以所选的校准样本的表达值，计算结果与2–ΔΔCT法的结果正好相同：
Ratio (reference/target) = 2CT(reference) – CT(target)
这个方法的数学前提与2–ΔΔCT法的相同。
当目标基因和参照基因的扩增效率相近时，用2–ΔΔCT法定量相对基因表达是最合适的方法，但是如果两个扩增子扩增效率不同，必须选择另一个方法来确定不同样本中目标基因的相对表达量。用下列公式确定测试样和校准样之间表达比率：
上述等式中，Etarget和 Eref分别是目标基因和参照基因的扩增效率，ΔCTtarget(calibrator – test) 是校准样本中目标基因的 CT 减去测试样中目标基因的CT，ΔCT ref(calibrator – test) 是校准样本中参照基因的 CT 减去试验样本中参照基因的CT。上述等式的前提：每个基因 (目标和参照 )在试验样本和校准样本中有相同的扩增效率，但是目标基因和内参基因之间的扩增效率可以不同。
由于生物系统的复杂性，没有任何一个内参基因对于所有的实验都是适用的，所以采用经过验证的两个及以上内参基因来做归一化是最适当且普遍适用的方法，即Vandesompele法，公式如下：
Bio-rad CFX Manager软件中融入了基因表达的各种计算方法，能使定量实验结果更准确。
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