人血浆中缓激肽的SPE LC-MS/MS定量检测方法（一）

关键词
生物分析，Oasis，样品制备，肽定量，缓激肽，UPLC，CORTECS，血浆

简介
缓激肽是一种含有9种氨基酸的生理和药理活性肽，由蛋白质的激肽基团衍生而来（图1）。激肽是可以促使血管舒张、血管通透性增强、一氧化氮释放和花生四烯酸流动的效应因子。它是血压、肾功能和心脏功能的重要调节因子，还参与炎症反应¹。缓激肽可引起血管扩张，从而导致血压降低。因此，对这种激素肽的变化进行高灵敏度、高选择性和高准确度地定量，并将其作为疾病进展或药物治疗的评估指标，将会极为有利。尽管以往都是通过配体结合试验（LBAs）对生物制剂进行定量分析，但在过去几年中利用LC-MS/MS分析大分子已成为一种趋势。这在某种程度上是因为LBAs产生显著的交叉反应问题并且缺乏标准化。LC-MS/MS具有多种优势，例如开发时间更短、准确度和精度更高、可重复进样，并且容易区分相似度很高的类似物、代谢物或内源性干扰物。常见的肽通常难以通过LC-MS/MS进行分析，这是因为其不易离子化以及不易产生理想的碎片离子而导致MS灵敏度较低，从而使得LC和样品制备方法开发非常困难。由于缓激肽在血浆中的浓度低至pg/mL水平且代谢速度快，在采血和样品制备过程中还可通过蛋白水解人为生成，因此对其进行准确定量相当困难。

本研究采用了专门设计的血液收集技术以防止体外缓激肽的形成，并且利用混合型固相萃取（SPE）和高效实心核颗粒色谱柱，最大限度降低并消除基质干扰的同时提高定量分析的灵敏度。

简介

方法条件
系统：ACQUITY UPLC
色谱柱：CORTECS UPLC C₁₈ 1.6 µm，2.1×50mm
流动相A：0.1%甲酸水溶液
流动相B：0.1%甲酸乙腈溶液
梯度：见表1
柱温：35摄氏度
样品温度：15摄氏度
进样体积：10 µL
总运行时间：3.5 min
收集板：Waters 1 mL ACQUITY收集板

MS条件
MS系统：Xevo TQ-S
电离模式：ESI+
毛细管电压：3.0 kV
脱溶剂气温度：500摄氏度
锥孔气流速：150 L/h
脱溶剂气流速：1000 L/h
碰撞室压力：3.58×10（-3）mbar
碰撞能量：按组分优化，见表2
锥孔电压：按组分优化，见表2

数据管理
色谱软件：UNIFI®1.6
定量软件：UNIFI 1.6

数据管理
样品预处理

将10 μL内标（IS）赖氨酸 -（脱-精氨酸9）- 缓激肽（10 ng/mL）加入200 μL人血浆中并混合。然后使用5% NH4OH水溶液对样品进行1:1稀释并混合。