【产品名称】
通用名称：苯丙氨酸检测试剂盒
商品名称：苯丙氨酸检测试剂盒
英文名称：Phenylalanine (PKU) neonatal Screening Assay
【包装规格】480人份/盒
【预期用途】
此试剂盒可用于新生儿血斑中L-苯丙氨酸的体外定量检测。仅供新生儿苯丙酮尿症的筛查。
苯丙酮尿症(PKU),是一种最常见的氨基酸代谢遗传病,它通过常染色体隐性遗传给子代,在人群中的发病率为1/2600—1/25000。
发病的主要原因（90—99%病例）是苯丙氨酸羟化酶的活性降低或缺失。苯丙氨酸羟化酶可以使必需氨基酸苯丙氨酸转化为酪氨酸，后者是儿茶酚胺、黑色素和甲状腺激素的前体，由于苯丙氨酸这个代谢的阻断，因而通过旁路代谢转化为苯丙酮酸和乙酸盐，通过肾脏排泄。
该疾病由于在出生后第一周,病人代谢抑制就表现出来。因为蛋白质代谢的改变引起大脑神经纤维异常的髓鞘形成对疾病的发展起主要作用。苯丙酮尿症的其它表现有真皮（和附属物）色素沉着的缺乏。是因为黑色素形成的紊乱，因而引起皮肤病。
在新生儿中对苯丙酮尿症的诊断是重要的,因为可通过低苯丙氨酸膳食避免脑损害。因而测定血中苯丙氨酸浓度的筛查试验，应在出生后3—5天进行，假如为阳性，应通过检测染色体特异的突变来进行确证试验。
为了检验苯丙酮尿症病人发展了许多筛查试验，最早的试验是由GUTHRIE 发明命名的，以枯草杆菌的生长习性来检测，枯草杆菌只能在高苯丙氨酸浓度生长。因为该方法的许多缺陷被其它的一些试验替代，这些实验是利用病人血液中的苯丙氨酸参与的化学反应，利用荧光或显色底物，进行测定。也可以应用更可信、更灵敏、更高级的高压液相色谱检测。
【检验原理】
将血斑纸上的苯丙氨酸用3%的三氯乙酸从滤纸上洗脱。
样本中的苯丙氨酸在外加苯丙氨酸脱氢酶的作用下转化成苯丙酮酸盐，此反应使存在于反应混合物中的辅酶NAD+再生。产生的NADH 使加入的黄色Tetrazalium 盐发生氧化还原反应生成紫色物质Formazane，在570nm波长测定OD值，OD值与病人样本中的苯丙氨酸浓度成正比。
【主要组成成分】
1、试剂盒成分
RE80015 | 标签 | 成分 |
1× | ENZ LYO | 酶，冻干粉，内含苯丙氨酸脱氢酶，辅酶NAD+，缓冲掖，稳定剂 |
1×45ml | ENZDIL | 酶稀释液，即用，内含二乙醇胺，缓冲液，0.01%的NaN3 |
1×55ml | SUBS | 底物，即用，内含四唑盐和柠檬酸盐。 |
1×5 | CAL A-E | 标准品A～E：1;3;6;12;18mg/dl，用2.EWS进行校准。内含人血液，Schleicher & Schuell滤纸编号：903.15血斑纸片。具体浓度请见试剂瓶标签或质控单。 |
1×2 | CONTROL 1+2 | 质控品 1+2 质控品1：1.8-3.0mg/dl 质控品2：4.0-6.0mg/dl 内含人血液，Schleicher & Schuell滤纸编号：903.15血斑纸片。具体浓度及可接受范围请见试剂瓶标签或质控单 |
1×2ml | DYE CONC | 显色储存液，51倍浓缩型，内含酸性黄23（C.I.19140） |
2、实验需要但试剂盒不提供器材
1）移液器（多道移液器或类似仪器：＜3% CV），体积：25;75;100;600;1000ul。
2）圆底聚苯乙烯试管（12×75mm）
3）试管架
4）试管振荡器
5）三氯乙酸（3%；w/v），用99.5%的三氯乙酸配得
6）0.5M的NaOH溶液
7）血液采集纸片（建议使用Schleicher & Schuell 903）
8）血斑打孔器，5mm（1/5´´）（例如：Sauer，Hannover，Germany）
9）微孔板（平底）
10） 微孔板振荡器（300-500rpm，振幅：1.5-3.0mm）
11） 可在570nm读数的酶标仪（参比波长：690nm）
12） 双蒸水或去离子水
13） 吸水纸，取样吸头和计时器
【储存条件及有效期】
试剂盒应当储存于2-8℃的环境下，避免太阳直射，有效期内稳定。样品的储存与稳定及试剂的准备将在相关单元中说明。有效期见试剂盒标签。
【使用仪器】通用酶标仪（配有570nm滤光片）
【样本要求】
血斑
应当从婴儿足跟的中部或内测收集足跟血,注意血液采集的常规注意事项.刺破足跟后,第一滴血应当用消毒纱布擦去.将采集卡对准血滴,让足量的血渗入到吸水纸上并充分填满预先印好的圆圈。重复操作，将所需数目的血斑都制备好。将血斑室温下凉干3小时，避免太阳直射。 | ||
注意 | 因为标准品是用Schleicher & Sshcuell No. 903滤纸确定的，所以滤纸的材料会影响实验结果，我们建议您也使用Sshleicher这种纸片。采血时请勿挤压穿刺部位，因为挤压会早成溶血或组织液稀释血液。不要在采血圈内连续滴血。请勿接触或涂抹血斑。确保血斑样品看上去符合实验要求（例如：血无涂抹，无凝块，血斑上无指纹）。 | |
注意 | 样品应当在婴儿出生后第三天到第五天的时间内采集。（出生后72到120小时内）。出生不到72小时就采集的样品可能产生假阴性结果。 | |
储存 | 2-8℃ | 避免热源和太阳直射 |
稳定性 | 6个月 |
【检验方法】
1、实验准备
（1）酶储存液的准备
注意 | 配置好的酶储存液在2-8℃可稳定存放5天。准备实验实际所需要的酶反应液即可。 |
在每支冻干的酶试剂瓶内加入12ml双蒸水，盖好试剂瓶，轻轻混合以使其充分溶解，混合2分钟，混合时避免起泡。 |
（2）酶溶液的准备
注意 | 如果您使用了好几支酶储存液，我们建议您将各管稀释液混合并确定混合液的浓度.重新配置好的酶储存液在18-25℃可稳定存放8小时，储存于2-8℃的环境下也不能延长它的有效期 |
酶溶液的建议配制量： 反应板数1/32/312345酶储存液（mL）0.81.62.44.87.29.612稀释液（mL）2.75.38.016243240 | |
按照上述表格用稀释液稀释酶储存液，充分混合2min，混合时避免起泡 |
（3）有色三氯乙酸（3%）的准备
用3%三氯乙酸按1：51的比例稀释显色储存液(如：加2ml浓缩型的染色储存液到100ml3%的三氯乙酸中。配置好的三氯乙酸在18-25℃的环境下有效期内稳定。 |
（4）血斑的洗提
用打孔器打下标准品、质控品和样品血斑纸片（直径5mm），分别放到相应的聚苯乙烯试管中，标上标签 | |
在每一试管中加入100ul 3%三氯乙酸，确保每一纸片都被溶液浸没。 | |
振荡器（300-500rpm，振幅：1.5-3mm）上室温（18-25℃）温育30-60分钟。 |
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