1、 应用范围
此试剂盒可用于人血清、血浆、血小板和尿液中五羟色胺的体外定量检测。进一步的研究表明：此试剂盒还可用于组织匀浆和细胞培养上清液的研究。
2、前言说明
五羟色胺是色氨酸代谢的中间产物，它主要存在于肠嗜铬细胞、血清素激活的神经元和血小板中，它已被确定为是中枢神经系统的一种神经递质。循环血液中的五羟色胺几乎都集中于血小板内。循环五羟色胺浓度的变化可反映出人体的一些病理变化，这些病理变化包括：慢性肌紧张性头痛、精神分裂症、高血压、舞蹈症、杜氏肌肉萎缩症和早期急性阑尾炎。血清五羟色胺的检测对类癌综合征的检测具有重要临床意义。人们预计：在不久的将来，人们对血小板内五羟色胺的研究兴趣（包括五羟胺的吸收及释放动力学研究）应该会不断增长。
3、实验原理
样品准备（将五羟色胺转变为N-乙酰五羟色胺）是样品的稀释的一部分，将每一份样品分别于酰化试剂一起温育就可以得到酰化的五羟色胺。此实验采用的是竞争性ELISA的原理，生物素标记的和非生物素标记的抗原竞争性结合到一定数量的抗体结合位点上。最后，结合到抗体上的生物素标记抗原的量于样品中被分析物的浓度成反比。当反应系统达到平衡后，洗板除去未结合的生物素标记抗原，用抗生物素碱性磷酸酶做标记、对硝基苯磷酸做底物来检测结合到抗体上的生物素标记抗原的量。用已知标准品做一条标准曲线，将未知样品的酶活性在标准曲线上进行定标就可以得到未知样品中五羟色胺的浓度。
4、贮存与稳定性
试剂盒和运输环境和储存环境温度为2-8℃，避免热源或太阳直射。样品的储存与稳定性及试剂的准备将在相关章节中阐述。打开了的试剂盒在有效期内稳定，前提是要将试剂盒用袋子密封并储存于2-8℃的环境下。
5、样品的采集与储存
注意 | 有些食物会含有一定量的五羟色胺，另外，有些药物也会刺激五羟色胺的释放，从而导致五羟色胺的浓度升高。病人应当禁食富含五羟色胺的食物，如：阿司匹林、促肾上腺皮质激素、MAO抑制剂、phenazetin、儿茶酚氨、利血平和烟碱。 |
血清
注意静脉穿刺采集全血的常规注意事项。从采集到血液样品的那一刻起到检测时都应保持血液样品的化学整体性。不要使用明显溶血、黄疸血和脂血样品。如果样品出现混浊，则在实验前应当离心以除去所有的微粒物质。 | ||||
贮存 | 18-25℃ | 2-8℃ | ≤-20℃ | 避免热源或太阳直射，避免反复冻融，冷冻状态下运输样品。 |
稳定性 | 2小时 | 6小时 | 3个月 |
尿液
可以是自然尿液也可使用24h尿液。收集病人24h内的所有尿液，之后将其加入到10-15ml 6N的HCl防腐剂中。确定用于结果结算的总体积。使用前请将所有样品混合并离心。 | ||
贮存 | ≤-20℃ | 避免热源或太阳直射，避免反复冻融。 |
稳定性 | 6个月 |
血浆、血小板
98%以上的循环五羟色胺都位于血小板内，在血液凝集时就可以释放出来。用静脉穿刺的方法将全血收集到含EDTA或柠檬酸的塑料试管中（如10mlMonovette NC试管中加入1ml柠檬酸溶液）。 室温下，将全血样品以200×g的速率离心10分钟得到富含血小板的血浆（PRP）。将PRP-上清转移到另一试管中。 为了获得血小板乳糜微粒，我们将200ulPRP（350000～500000个血小板/ul）加入到800ul生理盐水中，之后4℃下以4500×g的速率离心10分钟（或4℃下10000×g的速率离心2分钟）。离心后弃取上清。在血小板乳糜微粒中加入200ul双蒸水，之后样品就可以在-20℃以下的环境下冻存数周了。 将冻融的样品在室温下以1000×g的速率离心2分钟。整个实验需要使用20ul上清液（见酰化）。 如果您想测无血小板血浆（PFP）中五羟色胺的浓度，我们可以将PRP在4℃以4500×g的速率离心10分钟（或4℃下10000×g的速率离心2分钟）就可以获得无血小板血浆（PFP）。游离五羟色胺的ELISA实验要使用50ul上清液（见酰化）。 注意：PRP中五羟色胺的直接检测实验表明：大约10%的PRP样品可以检测到不可预知的高浓度五羟色胺（结果用高效液相层析和流氏细胞术获得）。为了避免这种差异性，我们建议您即检测血小板中五羟色胺，也检测无血小板血浆中的五羟色胺。 | |||
无血小板血浆 | 血小板微粒(从血浆中分离得到) | 避免热源或太阳直射，避免反复冻融，冷冻状态下运输样品。 | |
储存 | ≤-20℃ | ≤-20℃ | ≤-80℃ |
稳定性 | 2周 | 4周 | 1年 |
组织匀浆和细胞培养上清
使用组织匀浆和细胞培养上清作样品，一般无特殊注意事项 注意：细胞培养基可能含有一定量的五羟色胺！ | ||
储存 | ≤-20℃ | 避免热源或太阳直射，避免反复冻融。 |
稳定性 | 6个月 |
6、试剂盒成分
注意 | 试剂盒有足够做96份单孔检测或48份双孔检测所需的试剂成分。 |
数量 | 标记 | 成分 |
1×12×8 | MTP | 包被板，可拆，微孔中包被了羊抗兔抗血清。 |
1×5ml | ANTISERUM | 组胺抗血清，蓝色，即用，内含：兔抗血清、Tris缓冲液和0.01%的NaN3。 |
1×5ml | BIOTIN | 五羟色胺生物素，黄色，即用，内含0.1%的NaN3。 |
1×0.2ml | ENZCONJ CONC | 酶联物，10倍浓缩，内含碱性磷酸酶标记的抗生物素抗体、Tris缓冲液、HCl和0.01%的NaN3。 |
1×7×0.5ml | CAL A-G | 标准品A-G，0;0.08;0.24;0.73;2.2;6.6;19.8ng/ml,0;0.45;1.4; 4.1;12.5;37.4;112.3nmol/l,即用，内含酰化的五羟色胺、磷酸盐缓冲液和0.1%的NaN3。 |
1×2×0.5ml | CONTROL 1+2 LYO | 质控品1+2，冻干，内含人血清和0.02%的NaN3。具体浓度及可允许范围请见试剂瓶标签。 |
1×3ml | ACYLREAG | 酰化试剂 内含乙酸酐和丙酮，即用 |
1×50ml | ASSAYBUF CONC | 检测缓冲液，10倍浓缩，内含磷酸缓冲液、BSA和1%的NaN3。 |
1×50ml | WASHBUF CONC | 洗涤液，20倍浓缩，内含磷酸缓冲液、吐温和0.1%的硫柳汞。 |
1×9× | PNPP SUBS | PNPP底物片，密封于铝铂金属袋内，内含对硝基苯酚磷酸盐。 |
1×27ml | PNPP BUF | PNPP底物缓冲液，即用，内含二乙醇胺、水和0.05%的NaN3。 |
1×15ml | PNPP STOP | PNPP终止液，即用，内含1M的NaOH和0.25M的EDTA。 |
3× | FOIL | 粘性金属板 |
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