7、实验所需器材但试剂盒不提供
1） 移液器，体积：20;25;50;100;1000ul
2） 玻璃试管（12×75mm）
3） 试管架
4） 振荡器（500rpm）
5） 旋涡混合器
6） 水浴箱，37℃
7） 带储器的8道移液器
8） 洗涤瓶，自动或半自动洗板机
9） 离心机：≥1500×g
10） 可在405nm处读数的酶标仪（参考波长：600-650nm）
11） 双蒸水或去离子水
12） 吸水纸、取样吸头和计时器
8、实验前的准备说明
供手动和自动操作参考用
注意 | 用于96孔检测的试剂成分可分成3次用。下述体积是使用4条（32孔）时所需要的体积。如果客户想将标准品从7支减为6支的话，我们可以省掉标准品G。则检测范围相应的减少到155ug/l（血浆）或706ug/l（血清，尿液，组织匀浆和细胞培养上清）。 血清、尿液、组织匀浆和细胞培养上清样品可以选择简短操作步骤进行，只需温育3.5个小时（但血浆样品不能采用简短操作步骤进行），以上样品也可以选择可选操作步骤进行检测（将样品温育一整夜），血浆样品必须按照温育一整夜进行检测。 |
8.1冻干或浓缩成分的准备
稀释/溶解 | 成分 | 加入 | 稀释剂 | 比例 | 备注 | 储存 | 稳定性 |
15ml | 检测缓冲液 | 150ml | 双蒸水 | 1:10 | 出现黄褐色并不会影响实验结果 | 2-8℃ | 2周 |
15ml | 洗涤液 | 300ml | 双蒸水 | 1:20 | 2-8℃ | 4周 | |
质控品 | 0.5ml | 双蒸水 | 静置15min,混合时无泡沫 | ≤-20℃ | 有效期内稳定 | ||
60ul | 酶联物 | 6ml | 稀释的检测缓冲液 | 1:101 | 临时配置,只能使用一次 | 18-25℃ | 2小时 |
3 | PNPP底物片 | 8ml | PNPP底 物缓冲液 | 临时配置，只能使用一次 | 18-25℃ | 5小时 |
8.2样品的稀释
样品五羟色胺浓度高于最高标准品的必须用检测缓冲液进行进一步的稀释。
8.3样品和质控品的酰化
样品A：血清，尿液，血小板提取物，组织匀浆和质控品
样品B：无血小板血浆
注意 | 请不要酰化标准品，标准品已经酰化了。 样品准备可使血清、尿液、血小板乳糜微粒、组织匀浆和细胞培养上清被稀释107倍，而血浆样品则被稀释23.5倍。结果计算时必须将此稀释因子考虑进去。 |
8.3.1样品A：血清、尿液、血小板提取物、组织匀浆和质控品
1 | 将质控品和样品A分别20ul加入到玻璃试管中。 |
2 | 在每一试管中加入100ul稀释好的检测缓冲液，旋涡混合。 |
3 | 在每一试管中加入25ul酰化试剂1（3%），加入后立即旋涡混合。 |
4 | 将试管盖好，将试管放到37℃水浴箱内温育15分钟。 |
5 | 在每一试管中加入2ml已稀释好的检测缓冲液，旋涡混合 |
6 | 1500×g下离心10分钟 |
注意 | 准备好的样品必须立即检测。其上清可在18-25℃下稳定存放1小时。 |
8.3.2样品B：无血小板血浆
1 | 将50ul样品B加入到玻璃试管中。 |
2 | 在每一试管中加入100ul稀释好的检测缓冲液，旋涡混合。 |
3 | 在每一试管中加入25ul酰化试剂，加入后立即旋涡混合。 |
4 | 将试管盖好，将试管放到37℃水浴箱内温育15分钟。 |
5 | 在每一试管中加入1ml已稀释好的检测缓冲液，旋涡混合 |
6 | 1500×g下离心10分钟 |
注意 | 准备好的样品必须立即检测。其上清可在18-25℃下稳定存放1小时。 |
9、实验步骤
9.1简短操作步骤（仅供样品A使用，不能应用于血浆）
1 | 将标准品、酰化好的质控品和酰化好的样品各50ul加入到相应的微孔中。 |
2 | 在每一微孔中加入50ul五羟色胺生物素。 |
3 | 在每一微孔中加入50ul五羟色胺抗血清。 |
4 | 盖板，室温（18-25℃）下振荡（500rpm）温育90min。 |
5 | 移去粘性金属板，弃取孔内反应液，每孔用250ul稀释好的洗涤液洗板3次,吸水纸上拍干以除去残余液体。 |
6 | 在每一微孔中加入150ul临时准备好的酶联物。 |
7 | 盖板，室温（18-25℃）下振荡（500rpm）温育60min。 |
8 | 移去粘性金属板，弃取孔内反应液，每孔用250ul稀释好的洗涤液洗板3次,吸水纸上拍干以除去残余液体。 |
9 | 如果有条件的话，可以用8道移液器加底物液和终止液。加底物液和终止液时，每孔间的时间间隔应当相同。使用主动置换型移液器并避免气泡产生。 |
10 | 在每一微孔中加入200ul临时配置好的PNPP底物液。 |
11 | 室温（18-25℃）下振荡（500rpm）温育60min。 |
12 | 在每一微孔中加入50ul PNPP终止液以终止底物反应，轻轻振板以使溶液混合均匀。 |
13 | 加终止液后60min内405nm处读取OD值。 |
9.2可选操作步骤（温育一整夜，样品A和样品B均适用）
9.2.1第一天
1 | 将标准品、酰化好的质控品和样品分别50ul加入到相应的微孔中。 |
2 | 在每一微孔中加入50ul五羟色胺生物素。 |
3 | 在每一微孔中加入50ul五羟色胺抗血清。 |
4 | 盖板，轻轻振板，2-8℃下温育16-20小时（一整夜）。 |
9.2.2第二天
1 | 移去粘性金属板，弃取孔内反应液，每孔用250ul稀释好的洗涤液洗板3次，吸水纸上拍干以除去参与液体。 |
2 | 在每一微孔中加入150ul临时配置好的酶联物。 |
3 | 盖板，室温振荡器上（500rpm）温育60分钟。 |
4 | 移去粘性金属板，弃取孔内反应液，每孔用250ul稀释好的洗涤液洗板3次，吸水纸上拍干以除去残余液体。 |
5 | 如果有条件的话，可以用8道移液器加底物液和终止液。加底物液和终止液时，每孔间的时间间隔应当相同。使用主动置换型移液器并避免气泡产生。 |
6 | 在每一微孔中加入200ul临时配置好的PNPP底物液。 |
7 | 室温振荡器上（500rpm）温育30分钟。 |
8 | 在每一微孔中加入50ul PNPP终止液，振板以混合孔内成分。 |
9 | 加终止液后60min内405nm处读取OD值。（参考波长：600-650nm） |
10、结果计算
将所有标准品、质控品和样品的OD值减去空白孔的OD值。在半对数坐标纸上，以标准品的OD值（Y轴，线性）对其浓度（X轴，对数）绘制出一条标准曲线，或采用自动计算的方法绘制出一条标准曲线。用Cubic spline、4参数或双对数可以得到较好的曲线图。在计算标准曲线时，应当应用到每一个标准品数值（两个数值中，明显逸出的数值应当被忽略掉，采用更加合理的一个数值用）。样品的浓度可以从标准曲线上定量得到。
由于样品被稀释了，所以最终样品结果必须乘以相应的稀释因子，单位为ng/ml。
血清、尿液、血小板、组织匀浆、细胞培养上清、质控品： ×107
无血小板血浆： ×23.5
进行了进一步稀释的样品结果应当乘以相应的稀释因子。
实验必须满足如下标准才符合要求：
50%OD/Odmax（ED50）：0.60-1.00ng/ml（平均0.8ng/ml）
△OD标准品A-标准品G≥0.80OD
转换系数：
五羟色胺（ng/ml）×5.67=nmol/l
如果样品中五羟色胺浓度高于最高标准品，则此样品必须按照实验前准备说明进行稀释并重新检测。
11、期望值
实验结果不能当作任何治疗结果的唯一原因，疾病的判断还应当与其它临床观察和诊断检测相结合。以下结果为正常人群的正常值（97.5%）：
样品 | 数量 | 单位 | 平均值 | 范围 |
血清 | 99 | ng/ml | 88.6 | 30-200 |
无血小板血浆 | 35 | ng/ml | 3.7 | 1.8-7.5 |
血小板 | 35 | ng/109血小板 | 490 | 217-861 |
24小时尿液 | 49 | μg/d | 83.1 | ≤200 |
（建议每个实验室读确定自己的正常值范围）
本译文仅供参考，详情请以原文为准。
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