数字PCR，LunaProbesTM和MAAB相结合可以检测到低于0.01%的等位基因的突变
数字PCR，LunaProbesTM和MAAB相结合可以检测到低于0.01%的等位基因的突变
Matt Poulson, Jason McKinney
Idaho Technology, Inc. Salt Lake City, Utah, USA
引言
低水平突变的检测促使了许多新方法的发展。我们结合现有的三个技术：数字PCR，非标记探针法和MAAB（突变等位基因的偏向性扩增）（见图1）。数字PCR（Vogelstein and Kinzler，1999）需要许多重复的样本使模板稀释至约1拷贝/反应。将原始的数字PCR进行一些改进后可以进行高分辨溶解曲线分析（HRM），要求模板稀释为5个拷贝/反应 (McKinney, 2007)。这表明，如果存在突变的等位基因，一个反应中至少包括20%的等位基因并且可以检测到异源双链的存在。通常数字PCR检测的灵敏度约为2%。并且灵敏度是可以增加的，这主要取决于重复检测的数量。非标记探针法在PCR反应中加入3’端封闭的非标记寡核苷酸（Zhou，2005）。在使用HRM仪器时除了进行扫描之外，非标记探针增加了基因分型的功能（见图2）。非标记探针的灵敏度大约在5%（Wall，2007）。MAAB利用非标记探针增加了稳定性，探针与野生型等位基因完全匹配，和突变的等位基因不完全匹配，使突变的等位基因得到优势扩增。MAAB的灵敏度可以低于1%（McKinney，2009）。本实验中，我们结合这三种方法来增加HRM的灵敏性和有效性。
材料和方法
苯丙氨酸羟化酶基因11外显子（PAH×11）存在一个SNP，使用标准的非标记探针法进行检测。两个等位基因纯合子样品进行了鉴定。野生型和纯合突变样本的标准化浓度为15ng，然后混合进行一系列稀释，突变的等位基因可以到0.01%。1%、0.1%和0.01%的等位基因样本然后连续稀释到5-100拷贝。之后，1%、0.1%和0.01%突变的等位基因使用96孔板分别采用数字PCR，数字PCR+非标记探针以及数字PCR+非标记探针+MAAB的方法进行实验。每个实验包括两个重复，100%野生型和100%突变样品每个反应15ng以及两个不加模板的对照。MAAB和数字PCR+非标记探针+MAAB的方法使用Eppendorf Realplex4 Master Cycler Pro S (Eppendorf, Westbury, New York)，退火温度为57℃，可以达到MAAB的条件。Eppendorf仪器的温度转换率可以达到6℃/s。快速的升温速率对于完成MAAB实验的PCR是至关重要的。在PCR退火时快速的升温速率探针和目的区域紧密结合从而有效的阻碍了野生型等位基因引物的延伸。快速的升温速率也可以减少野生型等位基因的扩增，探针和野生型等位基因链解链之后，在变性过程中减少了扩增WT等位基因的酶的时间。数字PCR和数字PCR+非标记探针在Bio-Rad IQ thermal cycler (Bio-Rad, Hercules, CA)上运行。退火温度为68℃，在72℃延伸，以去除任何等位基因的偏差。样品扩增完用LightScanner96进行溶解分析（Idaho Technology Inc., Salt Lake City)（见图2）。
结果和讨论
数字PCR每个反应使用的模板量为5ng（大约1.5copies）。数字PCR仅能对扩增峰进行分析。数字PCR在这一稀释浓度时可以成功扩增，并且可以检测到杂合样本中0.1%的突变。在其他等位基因的实验中，数字PCR不能够检测出样品中任何的突变的等位基因。加上非标记探针法之后不仅可以提高数字PCR的灵敏度，而且可以检测到每一个突变等位基因混合后的突变。数字PCR加非标记探针和MAAB的方法使突变的等位基因的检测能力增加了，42个样本检测到1%的突变混合，37个样本检测到0.1%，43个样本检测到0.01%（见图3）。尽管使用非标记探针和MAAB的数字PCR是技术上非数字化的模板拷贝数，但是仍要小于常规PCR的模板量。MAAB在高WT等位基因的背景下能够增加检测突变等位基因的能力。加上非标记探针的数字PCR和MAAB技术使用的模板浓度达到300pg（100copies/reaction）时突变的检测率仍旧能够达到0.01%（见图4）。
结论
检测低水平的DNA突变有许多用途。其中包括检测致病菌耐药性、非侵入性产前筛查，低水平体细胞突变以及检测外周血治疗后的一些其他疾病。结合使用数字PCR，非标记探针和MAAB后灵敏度可以增加10-100倍，而且可以通过具体的探针峰来确定突变的等位基因，可以减少测序的费用。
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