乳清蛋白在220nm和280nm下都有紫外吸收，本文选择两种波长对三种乳清蛋白（浓度均为5ppm）进行检测，结果发现虽然分析物在220nm下具有最大的紫外吸收，同时在该波长下其也具有较高的基线噪音和干扰，因此本文选择280nm作为检测波长，减少流动相中的基线干扰，如图4所示5ppm的标准色谱图。
流速、流动相优化
如图4三种牛乳清蛋白混合标准的色谱图，按照保留时间依次是Bα-La、Bβb-Lg和Bβa-Lg，对于高分子量的蛋白分析，采用Waters孔径为300À的ACQUITY UPLCBEH300 C18色谱柱进行分离，此外,考虑到大分子蛋白的传质特性，需要使用较小的流速，方能实现较好的分离。本文试验了0.1ml/min、0.2ml/min和0.3ml/min三种流速，0.1ml/min死时间达到2.5min，整体出峰时间较晚，峰宽加大，最终综合峰形、快速和分离度考虑选择0.2ml/min流速，如图4所示。
在当前的分析条件下Bα-La具有较好的保留，然后改变流动相配比，得到标准品的四种配比色谱图（如图5），由图可以看出，1号色谱峰图中Bβb-Lg和Bβa-Lg两种遗传变异体达到完美的分离（分离度=2.79）；随着梯度的变化，在保持Bα-La保留时间不变的情况下，逐渐加快Bβb-Lg和Bβa-Lg的出峰时间，两种化合物的分离度逐渐变化为1.97（4号色谱图），灵敏度也稍有增加。但是考虑在分析实际样品时，减少可能存在的杂质对分析物的干扰，本文采用1号色谱图梯度方法进行检测。
实际样品检测发现，样品的Bα-La前面有较多的杂质峰存在，因此为防止实际样品中低保留杂质对Bα-La的干扰，对图5的液相方法Bα-La保留时间进行了调整（如图4所示），Bβb-Lg和Bβa-Lg仍具有2.22的分离度。
方法的线性相关性及检出限
浓度分别为1.000、5.000、50.000、100.000
mg/L的三种乳清蛋白标准依次进样，进样量均为10μ
L，外标法定量。以峰面积A为纵坐标，浓度C为横坐标进行线性回归，分别得到Bα-La线性方程A=2.34e3×C-2.36e3，复相关系数R2=0.9997；Bβb-Lg线性方程A=1.32e3×C-1
. 3 0 e 3 ， 复相关系数R 2 = 0 . 9 9 9 5 ； B a - L g
线性方程A=1.24e3×C-1.36e3，复相关系数R2=0.9987。三种乳清蛋白在1.000-100.000
mg/L范围有良好的线性关系(如图6-图8所示）。并且经实验测定，方法检测限为1.000 mg/kg，图9为1.000
mg/L三种乳清蛋白标准色谱图，此浓度下Bα-La、Bβb-Lg、Bβa-Lg信噪比分别达到8、3和3，其中Bα-La可实现定量要求。
前处理方法讨论
前处理中有几个注意点，首先就是使用含0.2%
TritonX-100的0.3M
NaCl提取液，尽量不要超过3天，因为实验发现3天以后该溶液对乳清蛋白的提取和稳定效果会下降。其次样品加入提取液,调整pH后需要放置50分钟以上，因为发现放置和未经放置的样品，在离心后过滤膜时过滤的难易程度有较大差别，未经放置的虽较易过滤膜，但乳清蛋白提取率较低。其关键点还在于提取液pH值的掌握，本文对同一奶粉产品在不同pH下的提取情况进行了比较，如下图所示，pH在4.4-4.6之间没有太大差别，但是pH达到4.8和5.0时，Bβb-Lg和Bβa-Lg的峰形变差，尤其是Bα-La的的出峰位置完全被杂质所淹没，因此实验中需要控制pH值不要超过4.6。
实际样品检测结果
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