1.5 荧光与光学显微镜
在PEI包被 IbiTreat µ-Slide 8-孔反应板（德国Munich，Ibidi） 上培养皮质神经元细胞，培养 6 天。然后，将培养细胞固定于 +4°C 磷酸缓冲液（PBS）（pH 7.4） 多聚甲醛中。使用 0.2% Triton X-100/PBS 对神经元细胞进行透化处理，使用 10% （v/v） 标准山羊血清（NGS）与2% （v/v） 牛血清白蛋白 （BSA）PBS，于室温处理 1 小时进行终止。+4°C 环境下，将神经元细胞与神经元标志微管相关蛋白2 (microtubule-associated protein 2，MAP-2） （英国剑桥Abcam, ab11267, HM-2, 1:600 稀释）小鼠单克隆抗体共同孵育，孵育过夜。第2 天，将细胞与山羊抗小鼠二抗（Alexa Fluor® 488 goat anti-mouse IgG （H+L） (Invitrogen, 1:250 稀释）共同孵育。使用DMI6000 B 倒置显微镜（德国，Leica ）收集荧光成像信息，LAS AF 软件（德国Mannheim，Leica Microsystems 公司Leica Application Suite, Advanced Fluorescence 2.2.0）分析。使用配备有 Lumenera Infinity 2 数字摄象机（加拿大 Ottawa，Lumenera 公司）的Axiovert 200 显微镜（德国 Jena ，Carl Zeiss ）获取光学显微镜的成像信息。10x 2.5 NA 物镜 （德国 Jena ，Carl Zeiss）采光，通过相差进行成像捕获。INFINITY ANALYZE 软件 （Lumenera 公司） 数字成像记录与成像分析。
3 结果
3.1 神经元 HT-22 细胞增殖
为对神经细胞系 HT-22 的生长与增殖情况进行评价，将细胞以不同密度（4500、8000
与 20000 细胞每孔） 接种于 E-Plate 96 上，并使用xCELLigence RTCA MP 仪器进行监测，监测 48 小时。首先细胞粘附于培养孔表面后，阻抗会显著增加，后期实验中，HT-22 细胞增长稳定。最终的各生长曲线，斜率非常相似，仅各培养孔绝对 CI 值不同，CI 值随各自接种密度的（参见图 1A 与 B）不同而不同。
图 1：E-Plate 96 中的 HT-22 细胞浓度梯度，及谷氨酸毒性检测。
（A） 将指定细胞密度的 HT-22 细胞接种于 E-Plate 96 上，并使用 xCELLigence 系统进行 48 小时记录。接种后 24 小时，使用谷氨酸对细胞进行处理。（B） HT-22 细胞指数 （CI） 值，在谷氨酸添加时间点进行标准化。（C） 持续性xCELLigence 细胞监测后，于 E-Plate 96 中进行 MTT 终点实验，对细胞活性进行检测。
为进行 HT-22细胞死亡诱导，使用不同剂量的谷氨酸（3 与 5 mM）。这些细胞中，谷氨酸可导致谷氨酰胺的消耗，从而促进活性氧的生成，导致线粒体损伤与细胞死亡[2, 3]。谷氨酸处理后 8-10 小时期间，未检测到 CI 值改变。其后 4-6 小时期间，CI 值快速降低。阻抗曲线图反映出剂量依赖性的谷氨酸诱导的细胞死亡。阻抗测定后的E-Plate 96 反应板 MTT 实验结果进一步证实了本研究结果（参见图1C）。不同细胞接种密度与不同谷氨酸浓度下，细胞死亡的开始时间略有不同。如图 1B，xCELLigence记录阻抗图在药物给定时间点，对CI 值进行标准化。xCELLigence系统检测到的谷氨酸诱导的细胞死亡动态变化，同前期研究中谷氨酸诱导HT-22 细胞死亡的时间段及特征具有良好的重复性，包括线粒体断裂与细胞核 AIF 转位[2, 3, 4]。
3.2 CELLigence系统神经保护作用检测
为测定xCELLigence 系统是否可检测神经保护作用，我们使用预凋亡BH-3 蛋白BID的小分子抑制剂，即 BI-6C9，来防止谷氨酸对 HT-22 细胞的毒性作用。如图 2A 所示，在HT-22细胞预先添加 3 mM或5 mM的谷氨酸的情况下，BI-6C9可有效防止谷氨酸诱导的 HT-22 细胞的凋亡。仪器记录的 BI-6C9 处理的细胞，无论是否添加谷氨酸，其CI 值均持续增加，表明BI-6C9 可维持细胞形态并延长细胞生存时间。而且使用实验终止后的E-Plate 96 孔板，及在实验时平行设置的附加标准 96 孔板，进行细胞增殖（MTT）实验 ，均验证了BI-6C9-介导的保护作用（参见图 2B）。这些结果进一步证实了xCELLigence系统
可用于监测细胞活性。通过光学显微镜观察，将药物对 HT-22 细胞形态学的作用进行记录（参见图 2C）。添加谷氨酸后，细胞发生显著形态学改变，细胞固缩并从培养板脱落，阻抗降低。通过 xCELLigence 系统相应 CI 值监测记录，进一步证实了这种情况，监测记录表明，谷氨酸处理后，CI 值降低。然而在添加 BI-6C9 后，HT-22 细胞形态未改变，CI 值记录进一步证实了神经保护的作用（参见图 2A）。
图 2：细胞阻抗检测HT-22 细胞神经保护作用。
（A）xCELLigence 系统对检测Bid 抑制剂 BI-6C9 的神经保护作用。接种后，使用 BI-6C9 与/或谷氨酸对 HT-22 细胞进行处理，记录 24 小时细胞指数（CI）值。（B）通过 MTT ，对细胞活性进行检测，左侧列数据为E-Plate 96终止CI 后进行的检测，右侧列数据为标准 96 孔细胞培养板中进行的检测。（C）通过光学显微镜观察，记录药物对 HT-22 细胞形态学的作用。
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