第一代Sanger法为DNA测序打开了大门，但它高昂的费用限制了在大规模测序工程上的使用。当今发展迅猛的第二代高通量测序设备，包括Illumina的Solexa、Roche 454系列以及ABI的SOLiD系统等，使测序费用大幅降低到60-1美元/megabase。 它们共同的缺点是每条读出的DNA序列太短，大致在35-250之间，使得后续的装配工作困难重重。
现今，第三代测序设备也初露端倪。基于一个纳米级大小微孔的设备在将来有可能成为高通量、廉价且能得到较长DNA序列的单分子测序方法。纳米孔严格限制了DNA单链可以通过的空间，每次只允许一个核苷酸按照原有的次序通过。DNA分子通过纳米孔时，它们的序列会被逐一分辨出。整个过程无需繁琐的增扩、标示步骤。
图一
纳米孔测序使用DNA合成和光学识别技术。目标DNA被转化为较长的单链，每个原有的核苷酸被连续12次复制到新链上。经过杂交后形成双链结构，进入纳米孔前，其中一条链将被剥离。可用于制作纳米孔的材料比如氮化硅的厚度超过DNA分子的10-100倍，这就可能在同一时间内有1个以上的核苷酸在隧道内，引起互相干扰无法读出正确的数据。因此有必要在新链上多次复制同一个核苷酸。
荷兰Kavli Institute of Nanoscience开发出厚度仅为一个原子的新材料（graphene），是否能投入实际使用有待于进一步检验。
图二
每个纳米微孔的开闭由离子震荡控制，α-溶血素明确地分辨出微孔是否有DNA分子（图二 红色部分）。DNA链进入微孔的速率由电压调节。
图三 A 图三 B
核酸外切酶依附到α-溶血素的顶部（图三B 浅蓝色部分），持续地从单链上切割下碱基（金色）。单个碱基通过微孔内的氨基化环糊精（红色）时，它们的遗传符号（A，T，G或C）被逐一读出。几毫秒后，碱基穿过了整个纳米孔，到达双分子膜的另一端（图三 A）。
图四
横截面的电流探测遗传符号。核苷酸通过隧道时其自身的极性改变了原有的电磁场，由此探测器得知每个具体的遗传符号（图四）。4种核苷酸不同的结构赋予它们不同的电子特征，这是最初纳米孔测序的理论基础。
除了材料方面的问题外，纳米孔测序还有下列的难题有待于解决：
1. 控制核酸外切酶精确的切割DNA分子。
2. 如何实现对长DNA序列的测序。
3. 控制碱基在纳米孔内的移动。
4. 纳米孔的稳定性和可靠性。
在过去的几年里，第二代测序技术为基因研究做出了杰出的贡献，但是他们普遍存在长度和质量上的缺陷。为实验设计，数据分析和应用带来了不便。第三代测序技术有望克服以上的缺点。测序费用的降低使得过去只有大型研究机构才能开展的测序工作如今也可在普通的实验室进行。技术进步将会带来更多的方法，推动人类疾病治疗向前发展。
参考文献：
1. The potential and challenges of nanopore sequencing. volume 26 number 10 OCTOBER 2008 nature biotechnology.
2. DNA Translocation through Graphene Nanopores. Gregory F. Schneider, Stefan W. Kowalczyk, Victor E. Calado, Gregory Pandraud, Henny W. Zandbergen, Lieven M. K. Vandersypen, and Cees Dekker. Nano Lett., 2010, 10 (8), pp 3163–3167
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