PriCells –正常小鼠原代骨骼肌细胞培养

一、实验试剂

1、培养基： PriCells Medium + 10% FBS + 1% P/S + PriCells Supplement

2、冻存液： PriCells Medium + 20% FBS + 10% DMSO

3、洗涤液： 1 × PBS （pH 7.4 ）+ 1% P/S

4、染色液： 0.4% Trypan Blue

5、消化液： PriCells Isolation of Primary Cell Kit

6、检测试剂：鼠抗人及大鼠desmin一抗，肌球蛋白（myosin）单克隆抗体

二、实验器械

1、培养皿

2、培养瓶

3、直剪和眼科剪

4、眼科镊和止血钳

5、烧杯

6、15ml离心管

三、实验流程

取肌肉于平皿，Hank’s洗3次

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剔除脂肪、结缔组织

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肌肉标本剪约0.1cm3小块

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移至离心管，Hank’s洗3次

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静置1min，弃去上层液及漂浮组织

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0.25%胰酶，37度水浴消化20min，每5min摇动或吹打1次

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生长培养基终止消化，反复吹打，依次100，200，400目过筛

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离心，1000rmp,10min，弃去上清

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重悬，计数细胞，接种密度以5 × 10⁵个/ml

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悬液加入未经PPL包被培养瓶中，差速贴壁去除成纤维细胞，37度，1h

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转移包被瓶中，生长培养基培养，培养37℃，5%CO₂

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4d换液，以后每天换

四、实验操作

1、  新生小鼠拉颈椎处死，乙醇消毒腿部，在超净工作台内，取肌肉于平皿，Hank’s洗3次，剔除脂肪、结缔组织，将肌肉标本剪约0.1cm3小块；

2、  将剪碎的肌肉移至离心管，Hank’s洗3次，静置1min，弃去上层液及漂浮组织

3、  向上述离心管中加入0.25%胰酶，37度水浴消化20min，每5min摇动或吹打1次离心管，然后加入生长培养基终止消化；

4、  反复吹打后，依次100，200，400目过筛，滤液收集后，1000r/min离心10min；

5、  弃去清夜，用生长培养基重悬细胞，悬液加入未经PPL包被的培养瓶中，差速贴壁去除成纤维细胞，37度培养1h后，转移包被瓶中，生长培养基培养，4d换液，以后每天换液1次。

五、细胞鉴定

1、显微鉴定：刚分离出的原代细胞比较小，呈球形，折光性强。12h后，细胞开始贴壁，72h后贴壁完全，细胞逐渐延展成梭形，随着培养时间的延长，细胞增殖、迁移并逐渐规律性地沿一个方向排列。当细胞融合80%以上后，开始形成肌管。

2、免疫细胞化学染色1：肌卫星细胞胞浆中含有结蛋白（desmin），可采用鼠抗人及小鼠desmin一抗对卫星细胞进行免疫染色鉴定。

3、免疫细胞化学染色2：采用骨骼肌特异性的肌球蛋白（myosin）单克隆抗体检测。取含骨骼肌细胞盖玻片常规处理后进行myosin的细胞免疫化学染色，PBS代替一抗做阴性对照。结果判定：以细胞浆出现棕黄色颗粒为阳性染色。

六、注意事项

1、胰酶消化过程中，也可采用15min两步消化的方法进行。根据所取组织个体年龄决定，一般成年大小鼠采用两步消化效果好，幼鼠一步消化和两步消化差别不大。

2、传代培养代数不要太多，骨骼肌细胞传代能力有限，容易死亡。

3、骨骼肌细胞培养过程中，形态会发生较大变化。

4、肌肉组织要尽可能剔除表面的膜和脂肪组织。

七、PriCells细胞图片