一、实验试剂
1、培养基： PriCells Medium + 10% FBS + 1% P/S + PriCells Supplement
2、冻存液： PriCells Medium + 20% FBS + 10% DMSO
3、洗涤液： 1 × PBS （pH 7.4 ）+ 1% P/S
4、染色液： 0.4% Trypan Blue
5、消化液： PriCells Isolation of Primary Cell Kit
6、检测试剂：肌动蛋白、a-SMA或Desmin抗体，荧光标记二抗，4%多聚甲醛
二、实验器械
1、培养皿
2、培养瓶
3、直剪和眼科剪
4、眼科镊和止血钳
5、玻璃滴管
6、烧杯
7、15ml离心管
三、实验流程
成年大鼠，麻醉，无菌获取主动脉血管
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1 × PBS （pH 7.4 ）洗涤血管，剥去血管外膜外附着的组织
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纵向剪开血管，内膜向上，用钝镊子横向刮动血管内膜，去掉内皮细胞，用1 × PBS （pH 7.4 ）反复洗涤。
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用镊子横向刮动血管，刮下来中膜层，收集中膜用PBS洗涤，加入少量培养基（PriCells），将血管剪切为1×1mm3的小块，1 × PBS （pH 7.4 ）洗涤3次
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组织块中加入消化液（PriCells），转至15ml离心管中于37℃水浴恒温消化15min，间隔2-3min摇动，静置1min，收集消化液，重复消化3-4次。
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收集消化液，加入消化终止液（PriCells）终止反应
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离心，1000rmp,10min，弃去上清
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重悬，计数细胞
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接种密度以5 × 105个/ml
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培养37℃，5%CO2
四、实验操作
1、培养瓶预包被。试验前一天预包培养瓶，置于超静台吹干或45℃烘箱烘干（切记保持无菌），4℃冰箱放置，备用。
2、取材：正常成年大鼠腹腔注射5%苯巴比妥麻醉，75%酒精浸泡，无菌条件下迅速取出大鼠主动脉。
3、材料预处理：将获取的血管放入含有1% P/S的1 × PBS （pH 7.4 ）中反复洗涤，去除血管外部的血渍，洗涤液澄清，用无菌镊子剥去外膜面的残留组织。PBS洗涤净。
4、除去内皮细胞：将血管纵向剪开， 内膜面向上，无菌镊子沿中轴方向反复刮动内膜层4-5遍，去掉内皮细胞，用1 × PBS （pH 7.4 ）洗涤3次。
5、分离中膜：将去掉内膜的血管，继续刮动分离中膜，去掉外膜，用眼科剪将内膜剪碎为1×1mm3的小块，加入1 × PBS （pH 7.4 ），转移到15ml 离心管中，PBS洗涤3次，离心收集沉淀物。
6、消化：在洗净的内膜碎块中加入消化酶液，将离心管放入37℃水浴消化15min。
7、终止消化：吸出消化液入新的离心管中，按1：1加入消化终止液，中止酶反应；余下的组织继续加入消化液，消化15min ，重复消化3次。
8、收集重悬细胞：收集中止后的消化液于离心管中，1000 rpm，离心10 min，弃去上清，加入培养液重悬，染色计数细胞。
9、培养细胞密度：调整细胞密度以5 × 105个/ml 接种入培养瓶。
10、培养：放置于37℃，5% CO2培养箱中。
五、细胞鉴定
1、显微鉴定：相差显微镜下，可见细胞呈长梭状，具备良好的透光性。细胞之间呈现典型的波峰波谷样生长，有接触抑制的特点。
2、免疫组织化学鉴定 ：利用肌动蛋白、a-SMA或Desmin免疫荧光染色鉴别平滑肌细胞。
1) 细胞爬片。将洗净的盖玻片放入6孔培养板中，接种细胞为3×104个/孔，48小时候细胞可以长满，用镊子取出铺满细胞的盖玻片备用。
2) 细胞固定：用1 × PBS （pH 7.4 ）洗涤细胞，之后放入4%多聚甲醛中，固定10min，空气中自然干燥。
3) 特异性抗体：按照说明书稀释比要求稀释抗体，加入抗体，放置37℃孵育60min。
4) 洗涤：1 × PBS （pH 7.4 ）洗涤3次 × 15 分钟，晾干。
5) 标记性抗体：加入荧光标记抗体，37℃孵育30min。
6) 洗涤：1 × PBS （pH 7.4 ）洗涤3次 × 15 分钟，晾干。
7) 封片：封片剂封片。
8) 镜检：荧光显微镜下观察，平滑肌细胞胞质呈现较强棕红色荧光。
六、注意事项
1、为了保持细胞活力，大鼠适宜采用药物麻醉后取材。大鼠应严格消毒，无菌解剖，打开胸腔后换取另一套器械获取主动脉血管。
2、注意尽可能洗涤净血管内的残血，避免血细胞及某些血清成分对细胞贴壁的影响。
3、血管由内膜层，中膜层和外膜层三层膜结构构成，而血管平滑肌细胞主要分布在血管中膜层，采用机械刮除法去掉内膜后再获取中膜以分离细胞，从血管内膜面刮下的细胞可以收集计数，培养主动脉血管内皮细胞。
4、酶消化法分离血管平滑肌细胞，酶消化过度容易损伤细胞，影响平滑肌细胞的贴壁，因此消化过程中应针对所分离的细胞源组织的构成，选择适宜的酶，并严格掌握好酶的消化浓度和消化时间。
5、严格控制细胞培养条件。包括细胞培养用液（培养基，生长因子，血清，抗生素）的质量，浓度。
6、传代培养细胞接种量为5×104个（25 cm2培养瓶），细胞倍增时间为48小时。细胞传代培养最佳为5-8代， 传代次数增加，细胞体积增大，细胞间易相互融合，界限不明朗，细胞贴壁牢固，传代消化时间会有所延长。
七、细胞图片
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