(三)用沉降速度法分离细胞:
利用重力沉降(1g),或低速速率-区带密度梯度离心(<1000×g)也可以纯化各
种细胞。
下面举一些分离实例来说明这种方法。主要方法取自参考文献5,11,12,
用沉降速度法分离细胞举例
细胞样品 | 被分离细胞类型 | 梯度 | 离心时间 /RCF( × g) | 设备 | 结果 | 文 献 | ||
纯度 | 产率 | 活力 | ||||||
白血球 | 淋巴细胞(a) 单核细胞(b) | BSA(1.5~6.5%) | 9 分/20× g | 特制离心室 | a) > 90% b) ~ 90 % | a)90% b)67% | 99% | 5 |
白血球 | 淋巴细胞(a) 单核细胞(b) | Ficoll(2~4%) | 2 小时/1g | 重力沉 降室 | a) - b)69 ~ 77% | a) - b) 28% | >98 % | 12 |
白血球 | 淋巴细胞(a) 单核细胞(b) | Ficoll ( 3.4 ~ 16.9%) | 45 分/800 ×g | 低速区带转头 | / | / | / | 12 |
预处理白血球 | 淋巴细胞(a) 嗜碱性细胞(b) | Ficoll(4.5~9.5 %) | 15 分/85 ×g | 甩平转头100ml 离心管 | a) > 95% b)62 ~ 72% | a) > 90% b)30 ~ 50% | / | 11 |
人骨髓细胞 | CFU-C | Ficoll(2~4%) | 2h/1g | 重力沉降室 | / | / | / | / |
预处理的犬胃 细胞 | 壁细胞(a) 主细胞(b) | Ficoll(2~4%) | 50 分/1g | 重力沉 降室 | a) > 60% b) 85% | a) ~ 50% b) ~ 30% | / | 12 |
窦状肝细胞 | Kupffer(a) Endothelial(b) | Percoll (3.5~18%) | 8 分/16g | 特殊沉降室 | a) 98% b) 97% | a) 68% b) 86% | >95 % | 5 |
(四)细胞的离心浮选:
利用离心浮选法分离细胞最初是在1948 年由Lindahl 提出的,当时取名为“逆流离心” (文献12)。这个设想在上世纪60 年代中期由Beckman 公司研发成为商用浮选转头和浮选离心系统,经过逐步改进发展成目前的JE-6B(5ml,3,470×g)及JE-5.0(40ML,4,700×g) 和Hitachi 的R5E(40ml,5,000rpm )细胞浮选系统。现代的浮选分离可以用光学系统直接在TV 显示屏上观察离心浮选过程(透明锥形离心室)。
离心浮选法特点:
l 利用细胞悬浮在锥形离心室内受到的离心力,流体阻力和浮力的平衡关系实现不同
种类细胞的纯化,纯度很高。
l 不需要密度梯度;
l 适合分离纯化直径在5~50μm 的细胞;
l 收集细胞的数量可达107 ~1012 个(JE-5.0 或R5E);
l 通过光学系统可以观测浮选过程;
l 可以实现自动收集已纯化的细胞;
l R5E在离心机门上有照相机,记录浮选过程;
l 离心浮选室可以高温消毒(121℃,20分)
离心浮选系统组成:
l Hitachi或Beckman高速冷冻离心机;
l 离心浮选转头(日立R5E或贝克曼JE-5.0);
l 环氧树脂透明离心室;
l 带流量计、蠕动泵及加样分配阀的加样系统;
l 浮选转头专用观察门盖;
l 可以实现自动收集已纯化的细胞;
l 光源组件(装在转头下方);
l TV显示系统.
例6 肝主质细胞倍体级分离(文献13)
l 所需设备同上述。
l 干细胞浮选用介质:L-glutamine(131mg/l),L-aspartic acid(13.3mg/l),
L-threonine(23.8mg/l), L-serine(31.5mg/l), glycine(37.6mg/l), L-alanine(53.5mg/l),
L-glutamic acid(132.4mg/l), KCL(223.7mg/l), NaH2PO4·H2O(96.6mg/l),MgCl2·6H2O
(101.7mg/l), NaHCO3(2.01g/l), glucose(3.60g/l), fructose(3.60g/l),
Sucrose(67.4mg/l).溶液调节到PH7.4,渗透压:308mOsm,配置后储存在-20℃待用。
l 肝主质细胞悬液,从三月龄雌性WAG/Rij 鼠取出;
l trypan 蓝染色剂。
l 结果:各种倍体细胞分布
二倍体(2n) | 四倍体(4n) | 八倍体(8n) | 16 倍体(16n) | |||
单核 | 双核 | 单核 | 双核 | 单核 | 双核 | / |