Bio-Mark™基因分析系统介绍

2020.7.20

王辉

致力于为分析测试行业奉献终身

美国Fluidigm公司www.fluidigm.com创立于1999年，总部设在美国加州。其创始人是Steve Quake和Gajus Worthington(公司CEO)。Steve Quake是美国斯坦福大学教授，是微液流领域（Microfluidic Technology）的权威专家http://thebigone.stanford.edu/。Fluidigm公司有两个产品线，蛋白结晶微芯片Topez和超高通量基因分析系统Bio-Mark™。其Topez的应用得到了象伊波拉病毒这样的蛋白结晶（《Nature》2008年7月份封面图片）。而其Bio-Mark™超高通量基因分析系统更是开创了超高灵敏度、超高通量基因分析的全新技术平台，得到了全世界超过100家重点生命科学研究机构（Stanford University,Myriad Genetics,GHC Technology）、制药公司(Merck Rosetta, AstraZeneca)及政府部门(Fred Hutchinson Cancer Research Center,NCI)等的广泛认可和应用。

Bio-Mark™基因分析系统是集成流体通路（Integrated Fluidic Circuit，IFC）技术、实时定量PCR技术及强大的基因分析软件相结合的技术平台。其创新技术就在于集成液体通路技术：利用集成电路制作工艺（光刻）在硅片或石英玻璃上刻上许多微管和微腔体，通过不同的控制阀门控制溶液在其中的流动来实现生物样品的分液、混合、PCR扩增。集成流体通路技术极大地简化了生物样品和试剂的分液操作，提高分析通量和灵敏度，其纳升级的反应体系为高通量的基因分析应用节省大量成本（试剂用量更少，样品量更少）。

Bio-Mark™基因分析系统由Bio-Mark™实时PCR系统（整合了高性能计算机）、IFC微液流芯片（耗材）、IFC Controller（将生物样品、反应试剂导入到IFC微液流芯片中）和数据分析软件四部分构成。IFC微液流芯片有2种：Dynamic Array（48.48动态芯片和96.96动态芯片）和Digital Array（12.765数码芯片和48.770数码芯片），应用于不同的基因分析中：拷贝数变化分析、遗传突变检测、基因分型、基因定量、单细胞基因表达等。

Bio-Mark™系统

从下面的具体应用及跟传统基因分析方法的比较上，我们可以很直观地看到Bio-Mark™基因分析系统在通量、灵敏度、灵活度上的革命性的突破。

1.BioMark™ Digital Array数码芯片 :

· 样本与试剂只需钠升级 (nL) 比传统方法少1,000倍, 大幅减少试剂用量

· 通过IFC部件, 样本浓缩1000倍, 敏感度大大提高，检测更准确，能检测到单拷贝, 高重复性

· 使用传统试剂, 操作简单快捷, 省去再开发时间

· 应用广泛, 如样本定量 (Slingshot), CNV, SNP, Genotype, Haplotype, 遗传病/突变检测等

（1）Bio-Mark Slingshot 系统 : 第二代测序仪样本浓度确定

——无需参照样本, 绝对定量, 高效替Roche GS 454、ABI SOLiD和Illumina Solexa等第二代测序平台上机前作样品浓度准确定量，可大大减少试剂用量！

（2）拷贝数变化 / 遗传病 / 突变检测

拷贝数变化（Copy Number Variation, CNV）广泛用于药物代谢、癌症、免疫相关疾病、人类基因组变异以及由基因变异引起的相关疾病的研究。

Bio-Mark^TM Digital Array

采用 12.765阵列PCR反应芯片，通过数字PCR，每个反应体系用量仅6 nL, 可有效分辨12与13倍（或更高）的差异。

采用常规PCR 方法和试剂, 无需改变工作流程, 结果一目了然, 方便比较

最多能兼容4种荧光染料，进行多通道PCR

传统分析方法（SNP微阵列分析或比较性基因组杂交(CGH)）：

· 敏感性和分辨率较低，缺乏客观标准，不能准确量化结果

· 操作烦琐, 需要大量本试剂，假阳性非常高

常规qPCR技术:

· 最多只能分辨2与3倍的DNA拷贝数差异，试剂价钱昂贵。

2.Bio-Mark™ Dynamic Array 动态芯片：

· 高通量，最高每次可处理9216个qPCR反应（96样本× 96基因）

· 采用常规试剂方法, 用量为传统1% （反应为nL级）

· 无需繁琐加样, IFC全自动进样混合,减少人为误差

· 利用IFC技术自动操作，重复性好

· 样品、反应液组合自由多样，应用广泛，用户弹性大

（1）基因表达

· 样本量为nl 级, 能有效进行单细胞基因表达研究

· 适合干细胞/ 癌细胞研究

在2009年5月7日的美国Nature主页文章《A closer look at the single cell》中详细介绍了Fluidigm Dynamic Array在单细胞表达中的应用。详细内容请看链接
http://www.nature.com/stemcells/2009/0905/090507/full/stemcells.2009.71.html

（2）基因分型

——通过简单加样，Bio-Mark™ 基因分析系统能在短时间内分析成千上万个基因（96×96 / 48×48）：

· 少试剂用量、低成本

· 使用常规方法但更高通量

· 高检出率（Call Rate），>99.5%

· 快速高效，可日处理7万个基因型

对9000个SNP数据点进行分析时时，使用384微孔板与96.96 Dynamic Array的对比结果：

384微孔板96.96动态阵列Master Mix46,000µL240µlPrimer-probe9,200µL480µl总移液次数18,432192Plates241

近年来SNP的研究是一个热门课题，可用于SNP研究的方法和设备也层出不穷，而Fluidigm的BioMark Dynamic Array的出现是对SNP研究方法的一个非常重要的补充。我们通过对比一下几种市场上SNP中通量分析的主要设备来看看BioMark Dynamic Array有哪些优势。

指标	BioMark™	MassARRAY	OpenArray	SNPstream
生产商	Fluidigm	Sequenom	ABI	BeckmanCoulter
通量(SNPs/day)	70,000	100,000	200,000	4600~300,000
Maximum Multiplex level	96	384	3,000	48
Assay conversion rate	99%	80-90%	95%	80-85%
检出率 (call rate)*	99.5％	90-95%	99%	98.8％
准确率	>99.8%	>99.7%	>99.7	>99%
灵敏度（样本上样量）	2.5ng DNA	10ng DNA	125ng DNA	2ng DNA
一个分析流程时间	3小时	570分钟	~8小时	1－2天
技术	Real-time PCR	时间飞行质谱	End-point PCR	杂交方法
Cost per data point	~$0.06	~$0.03	~$0.10	~$0.10

*检出率（Call Rate）：对于SNP研究而言，检出率（Call Rate）是一个相当重要的指标，例如在一个样本上同时检测48个SNP位点，检测率为98.8%的方法，其检测的成功率是：98.8×98.8×98.8×…98.8=0.560=56%，而检出率是99.5％的方法，其检测的成功率则是：99.5×99.5×99.5×…×99.5=0.786=78.6％，可以看出检出率对检测的成功率的影响是显而易见的，同时检测的SNP位点数越多，影响越大。

尽管在通量上Fluidigm的BioMark Dynamic Array并不理想，但采用实时PCR分析方法，突出的指标特别是超高的检出率和简单、快速的分析流程，使得其在中通量SNP分析方法中具有相当的竞争力。

综合评定Bio-Mark™基因分析系统，

· IFC整合系统，简化传统荧光定量PCR操作步骤，使操作流程简化至1/48（48.48动态芯片）或1/96（96.96动态芯片）。

· 与ABI 7900 荧光定量数据具有很好的统一性。

· 重复性好，批内批间相关系数极高，p=00.0000。

· 超高通量，Dynamic Array最多可实现9216个样本的同时检测，Digital Array一张芯片上最多可同时进行10,000(12.765数码芯片)或37,000（48.770数码芯片）个反应。

· nl级反应体系，比传统试剂耗费减少100倍，成本消耗节省一倍以上。

· 人性化数据分析软件，使您更加灵活的得到可靠数据。

在实际的科研应用中，越来越多的报导显示了Bio-Mark™基因分析系统正迅速地被科研工作者应用到实际研究中，

· 中国学者使用BioMark超高通量遗传分析系统发表高质量文章

· NCI使用BioMark基因工程系统开展研究遗传与基因组

· 剑桥大学采用Fluidigm公司的EP1系统进行癌症和疾病的研究