MicroRNA(miRNA)荧光定量PCR原理

一、什么是miRNA?
MicroRNAs (miRNAs)是一种大小约21—23个碱基的单链小分子RNA，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（双链）但是和siRNA密切相关。据推测，这些非编码小分子RNA（miRNAs）参与调控基因表达，但其机制区别于siRNA介导的mRNA降解。第一个被确认的miRNA是在线虫中首次发现的lin-4 和let-7，随后多个研究小组在包括人类、果蝇、植物等多种生物物种中鉴别出数百个miRN As 。

二、miRNA是如何产生的？（

ri图一： Micro RNA 的产生

miRNAs 是转录后长片段的 RNA 分子（ pri-miRNA ）的一部分，首先在细胞核内被双链 RNA 特异的核酸酶Drosha 处理成为 70-100 个核苷酸组成的发夹结构 RNA （ pre-miRNA ）。这一发夹结构 RNA 运输到细胞质，被另一个双链 RNA 特异的核酸酶 Dicer 剪切，得到 19-23 个 核苷酸组成的成熟的 miRNA ，结合在与 RNA 介导的沉默复合物（ RISC ）类似或者相同的复合物中，这个复合物参与了 RNA 干扰。由 miRNA 和靶基因 mRNA 的碱基配对引导 RISC 降解目的片段或是阻碍其翻译过程。 miRNA 和它的目的 mRNA 互补的碱基配对决定了这个过程的特异性。通过抑制翻译还是降解发挥作用是由 miRNA 和它的目的 mRNA 之间的错配程度决定的，匹配程度高的目的 mRNA 将被降解。由于 miRNAs 可以对不完全互补的 mRNA 配对来抑制蛋白质的翻译过程，因而每个 miRNA 可以有多个靶基因，而几个 miRNAs 可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个 miRNA 来经济地调控多个基因的表达，也可以通过几个 miRNAs 的组合来精细调控某个基因的表达。对于基于 miRNA 调控基因表达的研究的逐步深入，将帮助我们理解高等真核生物的基因组的复杂性和复杂的基因表达调控网络。

三、miRNA荧光定量PCR基本原理
实时荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光试剂，利用荧光信号实时检测PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR能够专一、灵敏、快速、高重复性地精确定量起始模板浓度。但是就成熟的microRNA而言，由于其是由21-25个核苷酸组成的小RNA，长度太短，并不能通过传统的实时定量PCR进行检测,但是通过特殊设计的茎环结构的反转录引物，配合实时定量PCR引物及探针可以精确检测微量样品中microRNA表达水平，也可以用终点PCR法定性检测。

图一 miRNA 实时荧光定量PCR原理

虽然 microRNA 实时定量PCR是一种最近才发展起来的检测技术，其技术细节还在不断完善中,但是microRNA 实时定量PCR检测系统，相对其它microRNA检测技术有以下优点：

1.高特异性 , 可以只对成熟 microRNA 进行定量，有效区分成熟 microRNA 分子和前体分子以及其它成熟 microRNA 的同源分子；

2.快速，简单，省时，整个操作只需两步，不到 3 个小时，即可获得高质量的数据；

3.检测灵敏度高，样品消耗少，仅需 1-10ng 的总 RNA 或 50pg 左右的 microRNA ；

4.超宽的线性范围，可跨越 7 个数量级；

图二 人的脑（ B ），心脏（ H ）和肝脏（ R ）组织中 microRNA 表达情况：分别采用实时定量 PCR ，终点法 PCR 和 Northern Blot 检测， RNA 用量和时间见图。

四、miRNA序列在线查找

http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/

参考文献
1.Livak KJ, Schmittgen TD: Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.Methods 2001, 25:402-408.
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4.Caifu Chen, Dana A. Ridzon, Adam J.Real-time quantification of microRNAs by stem–loop RT–PCR.Nucleic Acids Research, 2005, Vol. 33, No. 20